丹参粉对大鼠骨骼肌钝挫伤后肌纤维化和铁代谢相关因子的影响

李家林 ，储丽琴 ，唐志家 ，施 炜 ，罗雪莲 ，唐吉斌 ，邢益祥

（1.铜陵职业技术学院，安徽 铜陵 244000；2.铜陵市人民医院，安徽 铜陵 244000）

骨骼肌钝挫伤的修复过程要经过肌纤维再生和纤维化阶段，这阶段肌卫星细胞激活和相关因子的作用下，使得损伤肌组织内出现的肌成纤维细胞大量增殖活化；而肌成纤维细胞过度活化增殖产生的大量胶原纤维是骨骼肌损伤后纤维化的关键环节[1]。由于胶原纤维的沉积速度快于肌纤维再生，故损伤后纤维化难以避免[2]。少量的纤维化有利于修复，而过度纤维化发生则形成瘢痕组织。瘢痕组织起着机械性屏障，从而阻碍了损伤区域骨骼肌的再生，修复时出现瘢痕从而影响骨骼肌的功能。为了减少受损骨骼肌修复时出现过度纤维化发生，相关研究多集中在促或抑纤维生长相关因子方面。在治疗纤维化方面传统中药显示出独特的优势。国学理论称骨骼肌损伤为“筋伤”，其病机为筋脉扭挫，经筋受损，经络被阻，而致气滞血瘀,治以活血化瘀生肌为主[3]。丹参作为活血化瘀类药物代表，其抗纤维化作用引起了关注，研究多集中在丹参的脂溶性和水溶性成分的多种途径、多环节和多靶点的方面，可在调节铁代谢和铁死亡方面鲜有报道。细胞铁死亡可调节炎症损伤、信号转导和细胞生长，从而影响纤维化疾病的病理进程，但对细胞铁死亡在纤维化疾病中的机制研究仍处于初始阶段[4]。丹参注射液已广泛用于心血管疾病的治疗，丹参注射液局部应用于骨骼肌钝挫伤治疗可能导致二次损伤，增加瘢痕组织的增生，最终影响骨骼肌的愈合质量。丹参粉是丹参经过现代工艺粉碎加工后所得到的粉末状物质，质量稳定性更好，口服方便，已进入我们日常生活。本研究丹参粉灌胃对大鼠骨骼肌钝挫伤后肌纤维化和铁代谢相关因子的影响，目的是为骨骼肌钝挫伤后续治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

成年Sprague-Dawley大鼠，雄性SPF级，体重（243±25）g，66只 （购自郑州惠济区华兴实验动物养殖场）。每12h自然光暗循环，室温25℃，分笼饲养一周，自由饮水和进食。大鼠随机分为空白对照组（n=6）、模型组（n=30）和丹参组（n=30）。模型组和丹参组分别在伤后 1d、3d、5d、7d、14d五个时间点每组随机处死6只并取材，对照组于造模前取材。

1.2 建立模型

本实验参照 Markert等[5，6]人的实验方法，自行设计造模装置，不锈钢引导管，打击头为“T”形，打击头面积约1cm2，打击器重物为金属圆柱形，重220g，设计开关式下落，保证重物下降初速度为0，引导管内下落高度为110cm，打击由同一组人员一次性完成。用0.3ml/100g体重的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠取俯卧位，为充分暴露小腿腓肠肌，将右后肢置于伸膝、踝关节背屈、稍外展位固定；将打击装置的打击头紧贴腓肠肌肌腹中间，重物自由下落撞击“T”打击头，造成大鼠腓肠肌急性闭合性损伤[7]，肉眼观打击部位青紫肿胀明显，皮肤完整，大鼠苏醒后轻度跛行，确认胫腓骨无骨折，表明造模成功。

1.3 干预方法

对照组不做任何处理，丹参组在造模成功后给予丹参溶液灌胃，丹参浓度为0.25g/ml，将10g丹参粉溶于40ml灭菌蒸馏水中充分溶解配制而成。丹参粉购于云南金九地生物科技有限公司，产品批号：191003。根据动物给药剂量按“人-动物体表面积等效剂量比值表”折算，折算系数W=0.018，灌胃剂量为1.35g/kg·d[8]，于造模成功后12h开始灌胃，每天一次在同一时间点进行。模型组根据上述原理灌入相应剂量生理盐水。

1.4 取材

模型组和丹参组分别于损伤后第 1、3、5、7、14天随机取材，6只/次/组。大鼠麻醉 （10%水合氯醛，0.3ml/100g体重，腹腔注射）后，仰卧位固定四肢，打开胸腔暴露心脏，左心室取血，将血样置于4℃，3000r/min离心机里，离心 15min，取上清液置于-80℃冰箱保存，以备检测血清铁蛋白（serum ferritsn，SF）。大鼠放血处死后，迅速切取打击部位腓肠肌的肌腹，将其分为两部分，一部分肌肉组织用4%多聚甲醛溶液固定48h做石蜡切片，以备马松染色；另一部分肌肉组织-80℃保存以备检测热休克蛋白1（heat shock protein B1，HSPB1）含量。

1.5 肌组织HSPB1和SF含量的检测

ELISA法检测肌组织HSPB1及SF的含量。ELISA试剂盒均购于上海江莱生物科技有限公司，Infinite F50酶标仪，按照说明书将测得样品OD值代入标准曲线的直线回归方程，算得结果，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.6 组织形态学检测

4%多聚甲醛固定组织48h，自来水冲洗，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋切片，切片厚度4-5μm，行Masson染色。Masson试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，按照说明书进行染色。光镜下观察组织结构形态，使用MoticDigiLabⅡ-S图像软件收集组织学形态图片。

1.7 统计学分析

采用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析，对图像采用Image-ProPlus6.0软件进行测量。所有计量数据均用（±s）表示，采用单因素方差分析，各组间比较采用LSD检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模结果

大鼠打击造模后，皮肤无破损，打击部位青紫肿胀，胫腓骨无骨折，大鼠苏醒后轻度跛行，无反常活动，各组无显著差异，青紫肿胀部位一周后渐消退，已无跛行，后经病理证实造模成功。

2.2 SF含量的检测（图1）

图1 各时间点SF检测结果比较

模型组腓肠肌钝挫伤后血清铁蛋白逐渐升高，7d达到峰值，14d还没有回落到对照组水平，其中5d组与对照组比较差异有统计学意义（p＜0.05），7d与对照组比较差异显著（p＜0.01）。丹参组腓肠肌钝挫伤后血清铁蛋白升高后呈下降趋势，14d后低于对照组，其中1d和3d与对照比较差异有统计学意义（p＜0.05）；丹参组和模型组7d组比较差异显著（p＜0.01）。

2.3 肌组织HSPB1含量的检测（图2）

图2 各时间点HSPB1检测结果比较

模型组肌组织中HSPB1在损伤后先升高后降低，3d组最高，14d仍高于对照组，模型组与对照组比较差异有统计学意义（p＜0.01）。丹参组变化升高后趋向平稳，丹参组和对照组比较差异有统计学意义（p＜0.01）。丹参组和模型组比较差异有统计学意义（p＜0.01）。

2.4 组织形态学检测结果（Masson染色结果）

模型ld组，挫伤处可见肌纤维胞膜破裂，肌纤维间隙明显增大，间质内可见大量的炎性细胞浸润。丹参1d组肌纤维出现分裂，细胞间隙也明显增大，炎性细胞明显浸润，伴有红细胞渗出。模型3d组间质内中性粒细胞浸润减少，巨噬细胞数量明显增多，丹参3d组仍有较多的中心粒细胞浸润，巨噬细胞数量增多明显。模型5d组水肿减轻，间质内巨噬细胞数量减少，可见较多新生梭形肌纤维，且这些肌纤维体积较小，肌质也很少，排列紊乱。丹参5d组仍有水肿，细胞间隙较大，新生肌纤维增多，肌质增多，排列紊乱。模型7d组出现较多肌质饱满的红色新生肌纤维，纤维直径小，中央成核较多，细胞间隙出现蓝色胶原纤维。丹参7d组红色新生肌纤维增多，细胞间隙仅很少量蓝色胶原纤维出现。模型14d组挫伤区出现较多新生的肌纤维，体积小，中央成核多，细胞间隙出现较多蓝色胶原纤维。丹参14d组新生的肌纤维体积增大，数目增多，细胞间隙较大，出现蓝色胶原纤维。应用Image-Pro Plus 6.0软件分析测量胶原纤维占整个肌纤维的面积比例。丹参7d组与模型7d组以及丹参14d组与模型14d组比较p＜0.01，差异有统计学意义。（图3、4）

图3 模型组各时间点肌组织形态学观察（Masson染色，×400）

图4 丹参组各时间点肌组织形态学观察（Masson染色，×400）

3 讨论

生物体内的铁元素是细胞多种生化反应完成所必需的，如铁代谢异常，过多的铁积聚（铁过载）于组织会导致铁相关活性氧 （reactive oxygen species，ROS）增多、脂质过氧化聚集，进而导致细胞死亡的发生[9]，这是2012年由Dixon等[10]首次提出的铁死亡（ferroptosis）。铁离子是铁死亡的核心组件之一，相关研究表明骨骼肌挫伤后细胞内存在氧化应激[11]，当细胞铁代谢异常，铁过载时，游离Fe2+具有高氧化能力，其可催化氧化应激反应加速产生与脂质过氧化等有关的氧自由基和过氧化氢等活性氧（ROS)，导致线粒体和肌细胞膜受损。线粒体受损导致细胞出现能量危机，肌细胞膜受损导致细胞暴露在危险因素之下，从而导致细胞铁死亡，影响着肌纤维的再生和修复，最终导致纤维化的产生。

血清铁蛋白是反应储存铁状态的敏感指标，也是调控铁代谢的关键蛋白[12]。血清铁蛋白水平升高也反应了细胞内存在铁过载现象。铁过载引发脂质过氧化产生的ROS的积累被认为是铁死亡的标志[13]。血清铁蛋白可与内环境中的Fe2+反应，铁离子鳌合在内部的空心结构中，抑制铁氧化反应，通过芬顿反应的反应物阻止自由基的产生，从而起到抗氧化作用。本研究显示模型组腓肠肌钝挫伤后血清铁蛋白逐渐升高，其抗氧化性增强，间接表明模型组存在铁超载和氧化应激现象。丹参组腓肠肌钝挫伤后血清铁蛋白总体呈下降趋势，表明丹参改善了细胞的铁超载现象，减轻了细胞的氧化应激，从而降低了细胞铁死亡。

热休克蛋白 B1（HSPB1）也是调节铁代谢的关键蛋白，主要调节细胞内铁摄取及利用，其可通过抑制转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)的表达而降低细胞内铁离子浓度[14]，影响Fe2+的摄入，降低了细胞内亚铁离子浓度，稳定了细胞的内环境，减少了细胞的氧化应激，从而抑制细胞铁死亡。本研究结果显示模型组和丹参干预组肌组织内HSPB1都是先升高，模型组呈下降趋势，丹参干预组下降趋势不明显，维持在一定水平，二者均高于正常对照组。结果进一步表明丹参减轻了细胞内的氧化应激，稳定了细胞内铁离子的内环境，发挥了抗氧化作用，降低了细胞的铁死亡，有利于损伤后的肌纤维的再生和修复，减少了修复过程中的纤维化的产生。

Masson染色法能较好地区分胶原纤维和肌纤维，用苯胶蓝液复染，胶原纤维虽蓝色，胞质、肌纤维和红细胞镜下呈红色，胞核蓝褐色。本研究模型组7d组细胞间隙就出现蓝色胶原纤维沉积，14d组出现较多的蓝色胶原纤维沉积，丹参干预7d组细胞间隙仅有很少量蓝色胶原纤维沉积，14d组细胞间隙中出现的蓝色胶原纤维沉积少于模型同时间组，表明丹参能减慢胶原纤维的沉积，减轻了纤维化，有利于修复。

铁代谢失衡和过量铁蓄积可促进组织纤维化的发生[15]。细胞内铁过载也可致细胞内脂质过氧化促进纤维化的发生。本研究结果显示丹参的在抗纤维化方面可通过调节铁代谢相关蛋白质作用，稳定细胞内铁环境，降低细胞内氧化应激，防止铁死亡等方面有积极的作用。多种中药及其有效成分可通过干预细胞铁死亡发挥抗纤维化的作用[4]。因此，对铁死亡进一步进行研究，有望为骨骼肌钝挫伤修复过程中纤维化的防治提供新的靶点和方向。