2021年河南南阳地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传进化分析

饶 丹

（信阳农林学院牧医工程学院，河南信阳 464000）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的危害母猪繁殖系统和仔猪呼吸系统的一类烈性传染病。1987年，美国首次在商品猪中报告猪繁殖与呼吸综合征病毒，此后该疾病频繁发生并迅速蔓延到世界各地[1]。1995年我国第一次分离到PRRSV，此后，该病毒又在我国多地猪场中被发现[2]。PRRS对养殖经济效益的影响主要是导致母猪产仔率下降和断奶仔猪数减少。生长育肥猪感染PRRSV后可能会增加继发感染其他疫病的概率，最终造成死亡率增加，此外，治愈猪只则表现生长迟缓、屠宰猪年龄体重高度分散[3]。2006年，我国出现高致病性PRRSV引起猪无名高热，致使大量猪死亡[4]。2014年，NADC30-like毒株的发现是该病毒毒株出现的又一次重大变异，其结果是使用现有的商品化疫苗接种效果不好，给PRRS防控带来新的难度[5]。

PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arterividae）、动脉炎病毒属[6]，本病毒有囊膜且病毒粒子呈卵圆形，直径50～65 nm，结构为二十面体。PRRSV包含10个开放阅读框：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF 3-5、ORF2b、ORF 5a 和 ORF 6-7。ORF1a和ORF1b编码至少16个非结构蛋白：nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp2TF、nsp2NF、nsp3-6、nsp7α、nsp7β、nsp8-12。GP3和GP5在结构蛋白中也是高度可变的。nsp2、GP3和GP5常用于遗传变异和分子流行病学的系统发育分析[7]。由于遗传和抗原的差异，PRRSV分为：欧洲型（EU型，1型）和美洲型（NA型，2型）。我国主要以PRRSV 2的流行为主[8]。

近年来PRRSV不断发生变异，给养猪业造成难以估计的损失。为了更好地了解南阳地区该病的遗传变异情况以及为该地区的防控提供科学的依据，本研究对南阳地区疑似PRRS病料样品进行ORF5基因序列测定，同时参考国内外已知的基因序列绘制国内外PRRS的遗传进化关系示意图，分析南阳地区PRRSV的遗传变异规律，为我国PRRS的防控提供相关的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2021年在河南南阳（NY）地区采集8份疑似PRRS猪的脾脏、肺脏、肺门淋巴结等组织，并于-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

Trans2K DNA Marker购自北京全式金生物技术股份有限公司；Simply P病毒DNA/RNA提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；氨苄青霉素购自Solarbio；胶回收试剂盒购自OMEGA；大肠杆菌TOP10感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 引物设计

参考GenBank中发表的PRRSV ORF5基因序列，设计出扩增目的片段约为704 bp的特异性引物：GP5-F：5’-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGCC-3’；GP 5-R：5’-AAGGTGCTTTTGGCGTTTTC-3’。引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。

1.4 ORF5基因的扩增及克隆

无菌采集患病猪的淋巴结、脾脏等组织作为病料，取1 g置于1.5 mL的EP管中，并用手术剪剪碎，加入没过2/3病料组织的0.9%生理盐水；研磨后匀浆，8 000 rpm离心3 min；取上清液置于一新的1.5 mL EP管中，并按核酸提取试剂盒要求操作提取总RNA。以其为模板，采用AMV反转录酶进行反转录制备cDNA。以cDNA为模板，GP5-F/GP5-R为引物，PCR扩增ORF5基因。参数如下：95℃3 min；95℃30 s、56℃30 s、72℃1 min，34个循环；72℃5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并用凝胶回收试剂盒回收，克隆于pMD18-T载体中，阳性重组质粒送祥音生物科技有限公司进行测序。

1.5 序列分析

参考GenBank登录的国内外PRRSV参考病毒株序列，利用DNA Star、MegAligen、MEGA 5.1软件对不同病毒株的ORF5基因序列进行比较分析，绘制PRRSV遗传演化图。PRRSV参考毒株信息见表1。

表1 PRRSV参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 ORF5基因的RT-PCR扩增结果

对采集的疑似PRRS病料样品采用特异性引物进行PRRSV ORF5基因的RT-PCR扩增，结果显示，从患病仔猪的病料中扩增出8份阳性样品，分别命名为THX01、THX02、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08。琼脂凝胶电泳检测结果与预期相符（图 1）。

图1 疑似PRRS病料样品ORF5基因RT-PCR扩增结果

2.2 ORF5基因核酸遗传进化分析

对得到的8份阳性样品的基因测序均得到预期704 bp的片段。为分析各病毒株间遗传进化情况，采用DNA Star软件对获得的8个完整的ORF5基因序列及23个从GenBank下载的国内外参考病毒株序列进行多序列比较，构建南阳地区PRRSV毒株的遗传进化关系图（图2）。结果显示，进化树分为2大支，即以VR-2332为代表的美洲型分支和以Lelystad virus为代表的欧洲型分支。其中，美洲型又可进一步分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等5个亚型，代表毒株为NADC30、GM2、CH-1a、VR-2332和 HUN4表示。THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08 与 NADC30、JL580处于同一分支，亲缘关系较近属于Subgroup I。THX02与HUN4、JXA1等的高致病性代表毒株处于同一分支，亲缘关系较近属于Subgroup V。

图2 PRRSV ORF5基因遗传进化分析

2.3 GP5蛋白的氨基酸比对分析

目前已确定的美洲型病毒株GP5蛋白的表位有3个，2个为非中和表位（aa27～aa30和 aa180～aa197）如图3实线框表示；1个为中和表位（aa37～aa45）如图3虚线框；2个重要的抗原相关区域：胞外域（aa27～aa41）和C末端（aa180～aa197）。结果如图3，与V-R2332毒株相比，在非中和表位27～30位氨基酸，主要是第27和29位氨基酸发生突变；与美洲型代表毒株VR-2332相比，THX01、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08的第27位氨基酸V突变为A。而这6株与NADC30、JL580、CHsx1401一致。在第28位氨基酸处只有XYX08株发生突变，由L突变为F。在第29位氨基酸处与美洲型代表毒株VR-2332相比，XYX05、XYX06 和 XYX07 的 A29T，THX01、THX02、THX03、THX04、XYX08 与 RespPRRS-MLV、CH-1a、CH-1R、HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、QYYZ、GDsg、NADC30、JL580、CHsx1401一致。在aa180～aa197中，在 185位 8个毒株与 HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、QYYZ、GDsg、NADC30、JL580、CHsx1401一致，但与VR-2332相比发生V突变为A；在第189位，THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07和 XYX08与 Resp-PRRS-MLV、QYYZ、NADC30、JL580、CHsx1401 一致，但与VR-2332相比发生I突变为V。THX02与CH-1a、CH-1R、HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、GDsg一致，但与VR-2332相比发生I突变为L；在第191位，THX01、THX04、XYX05、XYX06、XYX07与QYYZ、NADC30、JL580、CHsx1401一致，但与VR-2332相比发生R突变为K。THX02、THX03、XYX08与VR-2332一致；在第192位，8个毒株与VR-2332相比发生V突变为I；在第196位，THX02与QYYZ一致，与VR-2332相比发生Q突变为R。在中和表位aa37～aa45，主要突变发生在39位，THX02与HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、GDsg一致，但与VR-2332相比发生L突变为I。在第41、44位，XYX05、XYX06、XYX07与VR-2332相比分别发生L突变为S、N突变为K。总体来说，本试验8株与美洲型代表毒株相比，在非中和表位aa27～aa30中，发生V突变为A、A突变为T、L突变为F；和非中和表位aa180～aa197中，发生185位的V突变为A、189位的I突变为V、189位的I突变为L、191位的R突变为K、192位的V突变为I、196位的Q突变为R。在中和表位aa37～aa45，发生39位的L突变为I、41位的L突变为S、44位的N突变为K。显示基因间的突变，最终与其病毒的毒力差异相关。

图3 PRRSV GP5蛋白氨基酸比对分析

3 讨论

第一个PRRSV毒株（VR-2332）于1992年在北美洲被分离，第一个中国毒株（CH-1a）于1996年被报道以来，该病毒给我国养猪场造成了巨大的经济损失[9]。PRRSV变异快，各毒株之间存在较大差别。一般变异出现的中间型新毒株，其抗原表位发生突变，影响抗原抗体相互结合，致使PRRSV的疫苗免疫效果较差或失败。

因此，通过对南阳地区的PRRSV GP5分离株的序列变异进行研究，为合理选择疫苗和PRRSV防控措施提供科学依据。Zhang等[10]报道了近年来中国猪群中出现PRRSV的2个新的基因亚型：Ⅲ型和Ⅳ型。Li等[4]报道，我国的猪群在2013年就出现了NADC30-like毒株，该毒株可使母猪发热、流产。系统发育分析表明2型PRRSV分离株可分为5个亚属类型（I、II、III、IV和V），这些亚属类型的代表毒株分别为 NADC30、VR-2332、GM2、CH-1a和JX1A。在试验中观察到THX02与HUN4、JXA1等的高致病性代表毒株处于同一分支属于 Subgroup V。THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07和XYX08与变异毒株NADC30处于同一分支属于Subgroup I。对GP5蛋白氨基酸变异进行分析后，发现GP5蛋白的3个表位区域存在较多的氨基酸变异，说明基因之间的变化与两者之间的毒力有关。这些氨基酸位点的突变大概会致使GP5蛋白免疫原性产生变化，也可能导致疫苗免疫效价变低甚至无效，最终使猪场的疫苗免疫失效。

4 小结

在河南南阳地区分离的8株繁殖与呼吸综合征病毒的GP5分离株，1株THX02属于高致病性毒株，其余7株属于变异毒株，说明南阳地区猪场中猪繁殖与呼吸综合征病毒的高致病性毒株仍在流行，同时有PRRSV变异株出现，因此有必要实时监测PRRSV的毒株流行情况，为该地区防控PRRS提供参考。