非洲猪瘟病毒PCR检测在养殖环节的应用

刘 敏

（廊坊市农业农村局，河北廊坊 065000）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪的一类急性、热性和高度接触性传染病，该病毒属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的一种双股DNA病毒，其至少能够编码34种结构蛋白，并且这些蛋白在传代后发生变异的概率非常大，给后期的疫苗研制以及疫情防控造成了较大的难度。生猪感染非洲猪瘟后会有较明显的临床反应，主要表现为体温明显升高，皮肤充血严重，患猪出现水肿，脏器出血，妊娠期的母猪还会出现流产、死胎等情况，患病猪的死亡率可高达100%，被我国列为一类动物疫病，同时世界动物卫生组织（OIE）也将其列为必须上报的动物性疫病[1]。自1909年该病在肯尼亚被首次报道后，开始在非洲各国流行，随后逐渐向世界范围内扩散，2018年非洲猪瘟首次在我国发生，给我国的养猪业造成了严重的打击。至今为止，非洲猪瘟已经在非洲、亚洲以及欧美等多个国家和地区流行，由于其高传播性、高致病性以及高致死率等特点，该病受到了世界各国的高度重视。非洲猪瘟的防控形势非常严峻，只有在养殖过程中建立一种快速、灵敏、准确性以及特异性均比较好的检测方法，才能为更好地预防该病提供条件。

1 非洲猪瘟的病原特点

非洲猪瘟病毒颗粒的直径在175～215 nm之间，为二十面体对称结构，病毒表面具有囊膜，基因组的大小为170～190 kb，为双股线状DNA。该病毒可以通过多种途径传播，主要以接触性传播为主，可以从感染猪只的血液、脏器以及组织液或其他排泄物中分离出来，患病猪以及隐性带毒猪为该病的主要传染源，通常情况下，感染猪只在发病前的1～2 d即可通过口、鼻、咽喉等进行排毒。非洲猪瘟病毒可在无光照且低温环境下的血液中存活6年之久，在正常的室温中可以存活几周，对高温较为敏感，在55℃的环境中经过30 min即可被灭活，在60℃的环境下6 min即可被杀灭。

2 非洲猪瘟的检疫现状

当前，尚未出现特异性治疗非洲猪瘟的方法，各大养殖企业主要采取各种预防措施，降低该病的发生，以减少该病所带来的损失，防止非洲猪瘟病毒的输入成了防控的重中之重。其中，动物及其相关产品的检验检疫就成为了第一道防线。首先，各国均根据相应的法律法规对进出口产品进行严格的检验检疫。其次，各大养殖企业在引进生猪时进行严格的非洲猪瘟病毒检验检疫，包括猪肉、相关肉制品、冻精液或胚胎卵源等。在生猪养殖过程中，通过对各个环节非洲猪瘟病毒的检测，做到及时预警、及时防控，从而降低该病毒传入猪场的概率，对生猪产业的安全养殖具有非常重要的意义。在检测非洲猪瘟病毒方面需要建立一种敏感性高、特异性强的检测方式来提高整个检测过程的效率。当前能够检测诊断非洲猪瘟病毒的方法较多，包括：动物接种试验、红细胞吸附试验、免疫电泳试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、直接或间接免疫荧光试验以及间接酶联免疫蚀斑试验和PCR试验等，除PCR试验以外的诊断方式对试验室以及操作条件的要求相对较高，并且较为复杂，耗时较长，同时大多会涉及到活病毒的应用，具有一定的危险性。而PCR试验的敏感性以及特异性均比较高，且不会涉及到活病毒的应用，适用于疑似病例的诊断检测，可以用于养殖场内大规模的病例筛查，是当下非洲猪瘟诊断较为推崇的一种检测方式。近年来，随着检测技术的不断进步又出现了一种新型PCR技术——实时荧光定量PCR（Real-time PCR），与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR的优点是适用范围更为广泛，2种PCR检测方法的灵敏度及结果的可靠性均较高。

3 实时荧光定量PCR技术的原理

传统常规的PCR技术主要是通过质粒DNA模板进行PCR扩增，得到其循环反应的终产物，然后对其进行定量和定性分析，这种技术无法对起始的模板进行准确的定量，因此无法对扩增反应进行实时检测。与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术，通过在PCR的反应体系中加入荧光基团，既可以根据荧光信号的变化来实时检测PCR扩增反应过程中的每一个循环扩增产物准确的量变，还可以通过将Ct值与标准曲线的比对进行分析，即对起始模板进行准确的定量分析。

4 实时荧光定量PCR技术在非洲猪瘟检测中的应用

4.1 样品的采集

对于活猪可以无菌条件下采集EDTA抗凝血样品或者采集口、鼻拭子等样品置于pH值为7.2的PBS缓冲液中保存；对于病死猪则可以在无菌条件下采集肝脏、脾脏和淋巴组织等样品；对于环境样品主要采集病猪活动过的圈舍墙面、地面、饲槽、水槽以及猪场内的土壤和污水等；对于运输的车辆应采集车头、车尾轮胎以及车厢内的样品等[2]；同时，还应对养殖场以及饲料厂在生猪不同生长阶段的饲料样品进行采集并进行检测。

4.2 检测的仪器及试剂

4.2.1 PCR检测所需仪器

在进行实时荧光定量PCR试验之前应准备好以下仪器：4℃冰箱和-80℃冰箱、可加热的混匀仪、电子天秤、高压蒸气灭菌锅、耐高压离心管、一套1～1 000 μL的微量加样器、带滤芯的加样器吸头、超净工作台、生物安全柜、高速台式冷冻离心机、超声波水浴仪、实时荧光定量PCR仪、全自动核酸提取仪、电热恒温水浴槽、国产普通离心机等。当前生产PCR试验仪器的厂家较多，有多种国产和进口的产品可以选择，实验室可根据自身实际条件选择仪器，并明确其生产厂家[2]。

4.2.2 PCR试验的试剂与耗材

在进行PCR试验前应提前准备好专用的工作服、工作鞋以及工作帽等，并提前对试验环境做好紫外线照射消毒，以免造成污染，导致试验失败。提前准备好一次性手套和吸水纸、可移动的紫外灯等。准备好需要检测的非洲猪瘟病毒相关基因的引物、SYB green反应体系，如果直接购买非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒操作会更简单。

4.3 检测方法

在检测非洲猪瘟病毒时，严格按照购买的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒说明书的操作步骤进行[3]。

4.4 结果判定

进行实时荧光定量PCR试验应同时设置阴性和阳性对照组，通过对比Ct值与标准曲线，可以发现阳性对照组的Ct值＜35，并且会有特异性的扩增曲线出现，而阴性对照组应该无Ct值出现或Ct值≥40；同时，阴性对照组没有特异性扩增曲线出现，表示试验的结果是可靠有效的。此时，若检测样品的Ct值＜40，同时出现了特异性扩增曲线，则可判定为阳性。若被检测的样品没有Ct值或Ct值≥40，则可以判定该样品为阴性[3]。

4.5 试验结果及常见的问题分析

现阶段，基层兽医实验室利用实时荧光定量PCR检测等方法在养殖场内开展大规模病原学检测的活动较少。由于基层兽医缺乏试验经验或试验条件有限等因素限制，检测结果经常会出现试验不成立、易出现假阳性或假阴性，重复组试验结果不同等问题。

4.5.1 试验不成立

试验不成立主要表现为2种情况，一是阳性对照组无曲线或者Ct值＞35，这可能与阳性对照样品的反复冻融有关系。二是阴性对照组Ct值＜40，这可能与实验室的环境有关系，在试验前未进行彻底的消毒或在试验过程中的人为操作不规范造成污染等。

4.5.2 假阳性

检测结果出现假阳性可能与检测区域设置不合理、样品提取人员操作及试剂配制等未在超净台或生物安全柜中进行，操作方法不规范或核酸发生气溶胶污染、试验结束后未进行彻底消毒等有关系[4]。

4.5.3 假阴性

检测结果出现假阴性的情况主要可分为样品问题和人为因素等2方面，一是样品问题，如果在采血过程使用EDTA抗凝血管，则可能会出现肝素抑制PCR的反应，而采集的样品过少则可能使得EDTA全血溶液浓度太大，对试验造成干扰，而出现假阴性。Ct值＞35的检测样品在很大程度上会受到环境、试验操作手法等的影响。此外，样品保存的时间也对结果有较大影响，样品保存时间过长则非常容易导致假阴性。二是人为因素，主要是试验员在试验操作过程中的问题，例如少加样品、漏加样品重复检测以及人工标记信号对荧光信号造成干扰等。

4.5.4 重复检测结果不一致

造成重复检测结果不一致的主要原因可能与检测试剂反复冻融、样品前处理时未离心，或未混匀导致病毒的分布差异、混合的样品量太大及溶血样品中血红素的含量存在较大差异等有关。

5 实时荧光定量PCR试验时的注意事项

5.1 提高人员操作标准性

进行PCR试验操作的人员应该熟练掌握PCR的原理、操作方法和步骤，并且按照相关的操作规程与标准严格进行试验操作，注重每一步的操作细节，如提前做好实验室的灭菌处理，加样加液时小心匀浆，防止产生气溶胶等，避免由于试验操作不规范导致试剂样品污染，造成试验结果有误差。

5.2 提高生物安全规范性

对检测非洲猪瘟病毒的PCR试验应使用认证合格的仪器进行检测，不同的设备与仪器不可混用，在进行试验前实验室环境与生物安全柜等至少要进行30 min的紫外照射消毒。试验结束后应对操作台及试验用具等使用75%的酒精等化学制剂消毒，对生物安全柜进行10 min以上的通风，并对环境进行30 min的紫外照射消毒。试验过程中所使用的试剂、产生的废料等应分别放置到相应的回收处，有专人保管，由生物安全公司进行统一处理。此外，二级实验室不具有保存非洲猪瘟病毒的条件，应当天检测后对样品进行及时的高压灭菌处理[5,6]。

6 小结

综上所述，实时荧光定量PCR检测技术的灵敏度较高，并且特异性较强，可以广泛应用于生猪养殖企业对非洲猪瘟病毒的排查以及患病猪群的疫情检测。但应注意试验操作的规范性，避免因为人为操作不规范、试剂仪器及试验环境等因素对试验结果的准确性造成影响。