猪瘟活疫苗效力检测方法的研究进展

陈建凯 张 璞 齐冬梅 赖月辉 侯高伟 周晓敏 吴浩平 曾垠涛

（1佛山科学技术学院，广东佛山 528225；2广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州 510530）

猪瘟（Classical swine fever,CSFV）又称为古典猪瘟，早期被养猪界称为猪霍乱（Hog cholera,HC）。该病是由家猪或野猪感染猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）后发生猪群相互传播的疾病，也是流行范围非常广的一种动物传染病，该病曾在世界上许多国家和地区广泛流行和传播。世界动物卫生组织（OIE）也将其列为A类16种法定传染病之一。猪瘟是给我国养猪行业造成巨大经济损失的一种非常严重的传染病，我国一直非常注重猪瘟的防控，《中华人民共和国动物防疫法》将猪瘟列为一类传染病。仔猪通常更易感染此病，免疫功能不全的发病症状更严重，患病猪一般表现为发热、出血，体温升高至41℃，有的患病猪体温甚至达到了42.2℃，而且高热稽留，症状维持数天。该病常常造成养猪场的猪只大批死亡，死亡率高达80%～90%。目前，疫苗免疫仍是预防猪瘟蔓延的有效手段，猪瘟疫苗的效价是否合格也是免疫成败的关键因素。现通过介绍猪瘟活疫苗的效力检测方法的研究进展，为检测猪瘟疫苗，确保猪瘟疫苗产品稳定性提供参考。

1 猪瘟病毒和猪瘟活疫苗简介

按照国际学术界对猪瘟病毒的认知，国际病毒分类委员会（ICTV）将CSFV划分属于黄病毒科，瘟病毒属，并且与之同属的病毒还有牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）和边界病毒（Border disease virus,BDV）。CSFV是一种包裹囊膜的单股正链RNA病毒[1]，该病毒的基因组全长是12.3 kb，含有一个大的开放阅读框，并且具有高度保守的5’和3’端非编码区，该病毒的阅读框是负责编码3 898个氨基酸的多聚蛋白，这种多聚蛋白在细胞蛋白酶和病毒特异性蛋白酶的作用下，产生裂解，裂解以后，产生4个该病毒的结构蛋白（C、Erns、E1、E2）和8个非结构蛋白 （Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B），尤其是E2蛋白，此蛋白是诱导宿主产生中和抗体的主要免疫原，在设计能区分感染与接种动物（Differentiability of infected fron vaccinated animals，DIVA）的疫苗上被广泛应用。该病毒粒子的直径为40～50 nm，呈球形，有二十面体对称的核衣壳，病毒粒子具有脂蛋白囊膜，囊膜表面上有6～8 nm的纤突，浮密度为1.15～1.16 g/mL，等电点4.8，沉降系数为140～180 S。电子显微镜下观察可以看到病毒粒子表面不规则的纤突结构。CSFV的存活力比较强，能够在50℃环境中存活3 d，37℃环境中可存活7 d。CSFV能在猪原代细胞和传代细胞上复制、繁殖，但不引起细胞病变（CPE）。

CSFV只有一个血清型，但分离到不少变异毒株。当前我国使用最广泛的是猪瘟兔化弱毒疫苗。1954年，我国科学家周泰冲等成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），并被世界许多国家使用，普遍反映我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗效果较好。该疫苗的毒株被国际上公认为标准弱毒株，称为中国疫苗株（C株）。2008年，中国兽医药品监察所宁宜宝等联合广东永顺生物制药股份有限公司成功研制出猪瘟兔化弱毒传代细胞疫苗，疫苗效价高、免疫原性好、对猪的保护力强，而且采用猪睾丸细胞（ST）培养，降低了用牛睾丸细胞培养可能造成BVDV污染的风险，该猪瘟疫苗的问世为我国乃至世界猪瘟防控做出了新的贡献。

2 猪瘟活疫苗效力检测方法

2.1 兔体定型热反应检测法

该方法是现行的《中华人民共和国兽药典》[2]中明确的猪瘟活疫苗检测的方法。兔体定型热反应检测法从20世纪50年代建立并沿用至今，也是目前我国使用最为经典的猪瘟活疫苗检测方法。每批猪瘟活疫苗经稀释后接种健康的新西兰大耳白兔，每只兔经耳缘静脉注射1 mL，然后每隔6 h进行体温测定，绘制体温曲线，计算出每头份RID含量。该方法比在猪活体免疫攻毒的方法简单，但仍受到兔子个体差异、饲养环境、接种应激等方面的影响，导致检测成本比较高，检测试验周期性较长，检测结果稳定性较差，可重复性较差。因此，该方法检测猪瘟活疫苗的弊端也日益显现，随着时代的发展和科学技术的进步，将会有新的检测方法补充或替代。

2.2 ELISA检测法

ELISA检测法是世界动物卫生组织（OIE）推荐的检测猪瘟病毒的最常用方法。也可用于规模化养猪场猪瘟抗体的监测。对猪瘟活疫苗系列稀释后接种猪睾丸细胞（ST）所收获的待检样品，采用抗原捕获ELISA检测试剂盒，样品中的猪瘟疫苗弱毒抗原被捕获，捕获的猪瘟疫苗弱毒抗原由瘟病毒特异性抗体（Erns）和辣根过氧化物酶标记物来检测。未结合的酶标记物被洗掉，再加入底物和色原体溶液。在酶的存在下，底物转化为可以与色原体发生反应的产物。采用ELISA方法进行猪瘟活疫苗效力检测。ELISA检测法的优点是不需要提取猪瘟病毒RNA，操作简单，而且该方法具有较高的敏感性和特异性。但是试剂盒的价格比较高。而且疫苗接种ST细胞后，第一次收获病毒液效价不稳定，二收、三收的病毒效价比较稳定。王海光等[3]采用抗原捕获ELISA法检测不同稀释浓度的猪瘟活疫苗中活病毒感染细胞后增殖出的子代病毒量，通过计算猪瘟活疫苗病毒的最高细胞感染剂量，建立猪瘟活疫苗效力检测方法。

2.3 间接免疫荧光法 （IFA）

CSFV在敏感性细胞（如ST细胞、PK细胞等）内生长不会引起细胞病变，显微镜下观察组织切片也不能看到明显的病变。因此可以采用间接免疫荧光（IFA）的方法检测猪瘟疫苗毒。间接免疫荧光法是采用一种抗原的抗体（或者称之为一抗），然后进行细胞孵育的时候发生结合，并且能够与对应一抗（或者称之为抗一抗）的抗体（可称为二抗，二抗上具有能够偶联的荧光素分子）和细胞孵育相结合，最后借助荧光显微镜进行观察判定。通过将猪瘟活疫苗稀释后，接种到猪睾丸细胞（ST）中，经培养、固定、洗脱、抗体结合后，在荧光显微镜下观察，如果含有猪瘟疫苗毒，则会看到细胞内及细胞周围有亮绿色的荧光，可判为阳性。根据稀释浓度及阳性率计算猪瘟活疫苗的效价。间接免疫荧光检测法的优点是试验结果直观，易于判断。缺点是疫苗毒接种细胞后培养时间长，导致检测周期长，需要专业能力较高的人员进行操作。而且，目前间接免疫荧光的方法多数为自建方法，不同厂家生产的荧光抗体等试剂差异较大，导致检测结果不稳定。

2.4 实时荧光定量PCR检测法

实时荧光定量PCR（Real time fluorogenetic quan-titative PCR,FQ-PCR）检测法是把PCR技术与荧光化学检测技术进行结合，并且在PCR反应体系中添加能够产生荧光特性的物质，这种荧光物质在PCR反应过程之前不产生荧光，当PCR反应持续进行，荧光信号就以特异方式被激发。荧光定量PCR是最敏感和最特异性的抗原检测方法。近年来，实时荧光定量PCR以灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，在传染病的检测以及其他定量方面得到了较好的应用。而且这种方法应用于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的效价，在我国也可以查到相关的论文。陈玉栋[4]等运用荧光定量PCR检测方法对猪瘟兔化弱毒疫苗进行检测，并与兔体定型热法比较，分析并验证了兔体定型热检测猪瘟兔化弱毒活疫苗与荧光定量PCR检测猪瘟兔化弱毒活疫苗之间具有良好的相关性。蒋春燕[5]等将荧光定量PCR技术与ABI定量检测系统相结合，建立了猪瘟病毒实时荧光定量PCR快速检测技术，检测猪瘟活疫苗弱毒，效果良好。上述介绍的研究，能够看到荧光定量PCR检测猪瘟活疫苗效价具有很好的应用前景。

3 检测猪瘟病毒方法与特点

目前检测猪瘟病毒抗原的方法主要是荧光定量PCR、ELISA抗原捕获法和间接免疫荧光技术。荧光定量PCR反应灵敏，如果操作不当，可造成假阳性；ELISA抗原捕获法避免了提取RNA的操作，但所用的试剂盒价格较高，且大多数依赖进口；间接免疫荧光（IFA）试验周期较长，而且荧光显微镜下观察结果时容易受到个人主观因素影响。

4 小结

随着科技的进步和行业的发展，尤其病毒学、兽医学和分子生物学的飞速发展。猪瘟活疫苗采用兔体定型热法进行效力检测的各种局限性越来越明显，因此，研究新型猪瘟活疫苗效力检测方法，探索实时荧光定量PCR、ELISA抗原捕获法、间接免疫荧光（IFA）等现代分子生物学检测技术，使得猪瘟活疫苗效力检测更准确、更方便快捷。先进的猪瘟病毒检测方法可以确保猪瘟活疫苗的产品质量，节省猪瘟活疫苗生产厂家的生产成本，提高疫苗生产效率具有重要的意义。