蛋白质组学在结直肠癌患者中医辨证分型中的应用进展

涂 浩,归明彬,邹 敏，杨自杰,王雅楠，张小凤，高 峰

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院，甘肃 兰州 730050；2. 宁夏医科大学研究生院，宁夏 银川 750004)

根据世界卫生组织公布的2020年全球肿瘤流行病统计数据，全球结直肠死亡人数居癌症死亡原因的第二位，发病率居所有恶性肿瘤第三位，而我国结直肠的发病率仍处于明显上升态势，已跃我国癌症发病率排行的第二位[1]。中医药治疗结直肠癌疗效确切，在抑制癌症患者术后肿瘤复发转移、减轻化疗毒副作用、提高生活质量及延长生存时间等方面具有一定作用[2-5]。中药治疗结直肠癌的基础首先是辨证分型，应用蛋白质组学技术探究结直肠癌不同中医证型的蛋白质差异方面的研究已经取得明显进步，以此为依据进行辨证治疗的方案亦正在构思。本文就近年来蛋白质组学技术应用于结直肠癌中医分型的研究内容进行综述。

1 中医辨证分型的研究现状

中医药治疗以辨证论治为核心，根据各种症状和体征进行分型，以选择不同的治疗方案。目前临床应用较多的标准是2008年由中华中医药学会发布的《肿瘤中医诊疗指南》，该指南将结直肠癌患者分为以下6个证型:脾虚气滞、湿热蕴结、气血两虚、瘀毒内阻、脾肾阳虚、肝肾阴虚[6]。但对于结直肠癌中医分型尚未建立统一的标准。例如邱艳艳等[7]对1994—2014年间大肠癌全部文献进行统计分析，结果可知：大肠癌分型中实证以湿热、瘀毒为主，虚证中以气血虚以及脾肾肝三脏虚弱为主。林胜友等[8]对780例大肠癌采用回顾性分析研究大肠癌中医证型分布，结果得出：初次及末次入院大肠癌中医证型均以脾虚型为主。葛青云等[9]对1992—2017年间关于大肠癌中医证型的文献进行统计分析，并采用《中医诊断学》及《肿瘤中医诊疗指南》的标准进行证型及症状的统一，结果可知：瘀毒内阻型、湿热蕴结在实证中多见，脾肾阳虚型及脾虚气滞型在虚证中多见，虚实夹杂以脾虚湿阻型、脾虚气滞型为主。王振祥等[10]对2008—2018年间大肠癌相关文献进行统计分析，证型出现频率排前三的分别是气血两虚、瘀毒蕴结以及脾肾两虚。综上所述可知，不同的中医评价标准所得出的相同疾病的中医证型也有所不同，因此统一结直肠癌的中医分型标准是非常重要的。

2 影响结直肠患者中医分型的相关因素

2.1自身状态对结直肠癌中医证型的影响 证型就是由不同的病因引起气血的不同变化导致人体的不同疾病状态，因此不同的病因会导致患者出现不同的证型。例如梁艳彬等[11]对140大肠癌患者中医证型与营养风险的分布进行研究可知肝肾阴虚证多见，瘀毒内结证少见，且肝肾阴虚证及气血两虚证患者营养风险较高，同时脾虚气滞证和脾肾阳虚症与营养风险呈正比。张华征等[12]对结直肠癌合并贫血患者的相关因素及中医证型差异进行分析，结果显示:大肠癌合并贫血的中医证型以气虚血亏证最常见，贫血程度更严重。张滢等[13]对120例大肠癌患者采用回顾性分析血糖水平与中医证型的相关性，可知复发转移组的患者空腹血糖水平明显高于未复发转移组，同时复发转移组男性空腹血糖高于女性，且复发转移组患者中瘀毒内阻证比例最高。

2.2化疗对结直肠癌患者中医证型的影响 患者受化疗影响结直肠癌分型也不尽相同，例如赵海燕等[14]采用聚类分析和主成分分析法对151例结直肠癌患者辅助治疗期间的中医证候进行分析，结果表明:中医证候分为脾虚湿阻证、气血亏虚证、肝肾阴虚证、湿热蕴结证和瘀血内停证5个证型[14]。王萧萧等[15]设计临床调查表对780例结直肠癌化疗期患者进行调查，结果得出：化疗后脾虚证及阴虚证例次较前增加且气虚证及血虚证较前减少。王国娟等[16]对1979—2014年间关于结直肠癌中医证型的文献进行统计分析，得出化疗后大肠癌患者以脾气不足型最多占总病例数的36.16%，占比最少的是脾肺气虚型为2.49%。

2.3手术对结直肠中医分型的影响 结直肠癌患者中医分型在手术前与手术后也不相同，例如宋晓锋等[17]对300例大肠癌患者术前中医证型进行统计，结果显示：湿热蕴结占比最高40.7%，其后依次为瘀毒内阻、气血两虚、脾肾阳虚、肝肾阴虚。胡春娜[18]对80例晚期结直肠癌患者术后早期中医证型以及临床标志物进行研究，得出术后早期中医证型以湿热瘀毒以及肝肾阴虚为主，同时这2组肿瘤标记物CEA、CA125也高于其他组，在肿瘤特异性生长因子(TSFG)阳性表达率方面也优于其他组。张彤等[19]对近20年结直肠癌术后中医证型相关文献归纳总结得出，大肠癌患者术后中医证候以脾虚为主。许云等[20]对218例结直肠癌患者术后中医证型辨证规律进行统计分析，将术后结直肠癌患者中医证型主要分为以下7种：肠燥津亏证，脾气亏虚证，脾胃不足证，肝阴亏虚、湿热内蕴证，肝胃不和证，肾气亏虚证，阳虚湿停证。吴静芳等[21]对228例术后结直肠癌患者中医证型进行统计分析，结果显示术后1个月较术前明显增加的证型是气血两虚证以及阳虚湿阻证，气血瘀滞、湿热蕴结较术前明显减少。

2.4生活环境对结直肠癌中医分型的影响 根据患者所在地不同以及生活环境的区别，相应的结直肠癌中医分型也有所不同。例如邵梅等[22]通过对近10年文献的统计分析，结果显示湿热蕴结、瘀毒内结以南方为主，脾肾阳虚、气血两虚、肝肾阴虚在北方多见。

2.5肿瘤的分期、部位、病理类型、转移等对结直肠癌中医分型影响 结直肠癌的中医分型与患者肿瘤分期、部位、淋巴结转移、远处转移以及是否手术存在一定联系。例如陈文婷等[23]采用回顾性研究中西医结合和单纯西医治疗对中晚期大肠癌患者生存期的影响，结果显示:肿瘤的部位、病理类型、浸润程度、复发以及转移均影响患者术后生存周期，中西医治疗中位总生存期为64.97个月，较西医治疗的23.60个月明显延长，中西医结合治疗后中位无病生存期为51.87个月，较西医治疗的29.27个月显著延长。不同部位的结直肠癌患者中医分型也有所区别，缪娴[24]回顾性分析147例不同原发部位结直肠癌的临床资料，结果显示：湿热蕴结型在直肠癌中多见，肝肾阴虚型在右半结肠中多见。肿瘤有无转移，相应的中医分型也有所不同。例如乔大伟等[25]采用前瞻性流行病学调查方法研究大肠癌患者肝转移的中医证型及其临床资料，结果发现：肝转移患者脾虚证高于非肝转移患者，同时患者肿瘤部位、浸润程度以及淋巴结转移均与肝转移相关。贾小强等[26]对97例结肠癌患者中医分型与肿瘤转移的相关性采用前瞻性研究，结果可知：实证中气血瘀滞证淋巴结转移高于湿热毒蕴证，虚证中气血虚弱证淋巴结及远处转移率教肝肾阴虚证低。

根据以上研究可知，化疗、是否手术、肿瘤的分期及转移在结直肠癌中医分型中占有重要地位，中医药治疗的关键是辨证论治，也是相同疾病选择不同治疗方案的基础，因此明确结直肠癌患者正确分型有助于临床治疗。

3 蛋白质组学技术应用于对结直肠癌的研究现状

3.1结直肠癌肿瘤组织与非肿瘤组织差异蛋白表达 蛋白质组是指在细胞、组织甚至生物体中表达的所有蛋白质，可以一次大规模识别数千种蛋白质的表达水平和修饰水平及其相互作用，阐明蛋白质在生命活动中的作用，为肿瘤发病机制和药物研究提供了新的研究思路。例如赵月鸣等[27]对结直肠癌组织及癌旁组织进行差异蛋白鉴定，确定20种差异蛋白，其中TPM4 蛋白在癌组织中表达明显增高。Ludvigsen等[28]通过双向凝胶电泳联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术鉴定来自肿瘤外周组织、肿瘤中心组织以及非受累部分的CRC患者组织。与非受累部分相比，肿瘤外周或中心部分表达水平受干扰的蛋白质包括S100A11、HNRNPF、HNRNPH1或HNRNPH2、GSTP1、PKM和FABP1。廖国海等[29]采用MB-WCX磁珠结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Mal-DI-TOF-MS)对结直肠癌患者血浆蛋白差异蛋白进行研究，结果显示：结直肠癌组有4个显著差异蛋白表达，荷质比(M/Z)分别为6683、8700、9187和9342。根据以上研究结果可知，结直肠癌患者肿瘤组织与邻近正常组织间存在明确的差异蛋白。

3.2结直肠癌早期诊断蛋白标志物筛选 结直肠癌目前常用的诊断方法包括血清肿瘤标志物、电子结肠镜结合组织活检。血清肿瘤标记物[癌胚抗原(CEA)、糖类抗原 19-9(CA19-9)]常被用来检测结肠癌术后复发及转移，因缺乏敏感性和特异性，并不能完全满足临床需要[30]。因此在结直肠癌早期诊断方面迫切需要灵敏度及特异性高的标志蛋白质。例如血清血小板反应蛋白2(THBS-2)是一种钙离子相关糖蛋白，参与血管生成、细胞运动及凋亡、细胞骨架构成以及细胞外基质反应等多个生物学过程，在结直肠癌患者血浆及肿瘤组织中表达明显高于非癌对照组，提示结直肠癌早期诊断等方面灵敏度及特异度均较高[31-33]。Gankyrin蛋白是一种癌基因表达蛋白，随着人类肠道黏膜不断更新排出体外，检查其粪便脱落细胞Gankyrin蛋白表达水平，可以早期提示结直肠癌，提高早期诊断率，并且与结直肠肿瘤的临床分级、转移等相关[34-36]。

3.3结直肠癌预后及转移的蛋白标志物筛查 结直肠癌患者五年生存率已逐步提升，但术后复发及转移仍是影响患者预后的重要因素，因此寻找结直肠癌术后复发及转移的预测蛋白质对降低结直肠癌死亡率具有重要意义。例如袁丽侠等[37]对比结直肠癌患者与健康人血清血清生长分化因子15(GDF-15)、层黏蛋白β-1(LAMB1)、UL16结合蛋白2(ULBP2)表达水平，结果可知：结直肠癌患者上述3种蛋白表达异常增高，且与患者肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移及预后密切相关。于姣姣等[38]对PubMed、EMbase、Cochrane Library、中国生物医学文献数据库(CBM)、万方等数据库进行检索，并系统评价人表皮生长因子受体2(HER2)与结直肠癌患者临床病理特征以及预后的相关性，结果显示：HER2在肿瘤分期、部位、淋巴结转移和肿瘤的浸润深度相关，HER2阳性在提示结直肠癌患者预后不良方面具有一定意义。

由以上研究可知，蛋白质组学在结直肠癌患者早期诊断、肿瘤转移、肿瘤分期以及预后等方面的检测具有重要意义，可以寻找灵敏度及特异度更高蛋白标志物，从而提高患者生存率。

4 蛋白质组学应用于结直肠癌中医辨证分型的研究

疾病的发生由机体整体功能的紊乱引起，这是中医学的基本观点。由于证候是致病因素与人体相互作用到一定阶段的综合反应，且这种综合反应应该有一定的分子基础。运用蛋白质组学的技术和方法进行定量和定性分析，进一步探讨结直肠癌证型分子基础，对于规范辨证具有重要意义。例如周小军等[39]采用二维凝胶电泳结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测湿热蕴结结直肠癌患者肿瘤组织和正常人结肠黏膜组织蛋白，筛选出22个差异蛋白，其中20种蛋白被鉴定，与对照组相比，湿热蕴结证结直肠癌有15个蛋白表达上调，5个蛋白表达下调。孙校男等[40-42]应用双向凝胶电泳联合质谱鉴定技术，发现大肠癌不同中医分型间存在明确的差异蛋白，提供了不同证型间的分子基础差异，为明确大肠癌中医分型的物质基础作出了贡献。季青等[43]应用iTRAQ标记和液相色谱串联质谱联用技术鉴定得出大肠癌术后肝肾阴虚证组、肝癌术后肝肾阴虚证组各筛选出9个典型差异表达蛋白，2组共同的差异蛋白有8个。徐玉芬等[44]通过双向凝胶电泳和质谱技术对辅助治疗期大肠癌脾气虚证、胃阴虚证、平和证型患者血清蛋白质组进行分析；结果显示3组证型间存在差异蛋白质，在胃阴虚证、脾气虚证患者血清中血红素前体、α-1-B-糖蛋白、色氨酸羟化酶-1、结合珠蛋白表达上升，而富含亮氨酸的α-2-糖蛋白-1表达均下降。在胃阴虚证患者中胰蛋白酶抑制剂HI30、转甲状腺素蛋白表达上升，但在脾气虚证患者中表达无显著差异。周利红等[45]对比大肠癌血瘀证与非血瘀证患者血液流变指标及促血管生成相关因子表达差异，结果可知：大肠癌血瘀证组患者的血清Angiogenin、ANG-2、EGF、bFGF、HB-EGF、HGF、Leptin、PDGF-BB、PIGF、VEGF表达水平明显高于非血瘀证组，提示血瘀证与肿瘤血管新生之间的关系密切。Ji等[46]采用 iTRAQ 合联合 LC-MS/MS 技术筛查结直肠癌术后和肝癌术后肝肾阴虚患者的血浆蛋白。结果表明：KNG1、AMBP、SERPING1等在肝肾阴虚证的术后结直肠癌和肝癌组织中均有差异表达，且与补体和凝血级联途径密切相关。郭勇等[47]利用双向凝胶电泳结合质谱分析对辅助器脾气虚证患者血清蛋白进行研究，结果可知：辅助治疗期大肠癌脾气虚证以及胃阴虚证中结合珠蛋白、色氨酸羟化酶-1、β-GDP解离抑制因子表达明显上调;富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1则下调。SP40,40蛋白质在胃阴虚证患者血清中表达下调,而在脾气虚证患者血清中表达上调;转甲状腺素蛋白(TTR)在胃阴虚证患者血清中表达上调,而在脾气虚证患者血清中表达下调。周利红等[48]通过对比大肠癌血瘀证患者肿瘤组织与非血瘀证患者组织的血管新生标记物、缺氧诱导因子(HIF)-1α以及血管内皮生长因子(VEGF)等表达水平，结果可知：大肠癌血瘀证患者肿瘤血管CD34、HIF-1α和VEGF的阳性表达明显高于非血瘀证患者，提示大肠癌血瘀证与肿瘤血管新生密切相关。由以上研究可发现结直肠癌患者不同中医证型间确实存在差异蛋白，说明不同证型间有明确的物质基础差异。

5 小 结

中医药治疗的关键是辨证论治，也是相同疾病选择不同治疗方案的基础，但是目前中医分型的辨证在临床上受医师经验影响较大，将蛋白质组学技术应用于中医分型的物质基础研究，以期寻找出不同中医分型间的差异蛋白质，有望为建立统一的结直肠癌中医分型标准作出贡献。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。