黄芪甲苷IV联合紫杉醇通过STAT3-NF-κB途径对胃癌细胞的作用研究

李全志，郑林静，刘志强

0 引言

胃癌是常见癌症，也是全球第三大癌症相关死亡原因[1-2]。近年来，尽管关于胃癌诊断、手术技术和新型分子靶向药物等方面的研究取得了很大的进步，但是胃癌患者的5年总生存率仍然较低，进展期胃癌患者5年死亡率高达30%～50%[3]。黄芪甲苷IV是一种羊毛脂醇型四环三萜皂苷，是中药黄芪的主要活性成分，具有多种药理作用，如抗炎、抗纤维化、抗氧化、抗哮喘、抗糖尿病和免疫调节作用[4]。此外，黄芪甲苷IV已被证明在某些癌症中具有抗肿瘤特性，可抑制肿瘤细胞的存活、迁移和侵袭[5]。紫杉醇是从短叶红豆杉树皮中分离出来的一种具有紫杉烯环结构的二萜类化合物，对人类多种疾病有效，如神经退行性疾病、癌症和慢性肾脏疾病[6]。紫杉醇是治疗癌症的有效药物之一，但是单一紫杉醇的抗癌能力有限，与其他抗癌药物相比，紫杉醇的有效剂量较高，化疗效果并不理想[7]。因此，研究者们不断探索新的紫杉醇联合用药方案，以期提高胃癌的治疗效果[8]。本研究旨在探究黄芪甲苷IV和紫杉醇联合用药对胃癌细胞的作用及其可能的机制，以期为开发胃癌新的治疗策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 人胃癌细胞株AGS购自武汉普诺赛生命科技有限公司；黄芪甲苷IV购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；紫杉醇购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒购自美国AbMole公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Bax和Bcl-2抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；STAT3、NF-κB、pSTAT3和pNF-κB抗体购自英国Abcam；GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology；超敏ECL发光液购自北京英格恩生物科技有限公司；Transwell小室购自美国康宁；Matrigel购自德国Sigma-Aldrich。

1.2 细胞培养 将液氮中冻存的AGS细胞取出，37 ℃水浴快速解冻，离心弃上清，1 ml含10%FBS 的Ham′s F-12培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6孔板中，补加Ham′s F-12培养基至2 ml。细胞于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每2天更换一次新鲜培养基。待细胞密度达到6孔板面积的80%～90%时，0.25%胰酶液消化细胞，按照1∶3比例传代培养。

1.3 黄芪甲苷IV和紫杉醇IC50的检测 0.25%胰酶液消化AGS细胞，新鲜培养基重悬细胞，制成单细胞悬液。取AGS细胞接种到96孔板中，每孔100 μl细胞悬液(5×103个细胞)。细胞继续培养12 h，弃去培养基。将细胞随机分为0 μg/ml组、5 μg/ml组、10 μg/ml组、20 μg/ml组、40 μg/ml组、80 μg/ml组和160 μg/ml组，按照分组，分别添加用不同浓度的黄芪甲苷IV和紫杉醇配制得到的培养基100 μl，0 μg/ml组添加等量溶剂。细胞继续培养24 h。CCK-8试剂盒检测各组细胞活力，细胞活力(%)=(不同浓度组OD值/0 μg/ml组OD值)×100%，GraphPad Prism5.0软件计算黄芪甲苷IV IC50和紫杉醇IC50。

1.4 CCK-8试剂盒细胞活力检测 对数期生长的AGS细胞经消化后，新鲜Ham′s F-12培养基重悬细胞，制成单细胞悬液。取AGS细胞接种到96孔板中，每孔100 μl细胞悬液(5×103个细胞)。将细胞随机分为对照组、黄芪甲苷IV组、紫杉醇组和联合组，其中黄芪甲苷IV组添加黄芪甲苷IV IC50浓度，紫杉醇添加紫杉醇IC50浓度，联合组添加黄芪甲苷IV IC50浓度+紫杉醇IC50浓度，对照组添加等量溶剂。细胞继续培养24 h、48 h和72 h后，向每孔内加入10 μl CCK-8溶液，细胞于37 ℃培养箱内孵育4 h。用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度(OD)。细胞活力(%)=(处理组OD值/对照组24 h OD值)×100%。

1.5 集落形成实验检测细胞增殖 对数期生长的AGS细胞经消化后，新鲜Ham′s F-12培养基重悬细胞，制成单细胞悬液。取300个对数期生长的AGS细胞接种于培养板中，将细胞随机分为对照组、黄芪甲苷IV组、紫杉醇组和联合组，按照 “1.4”项下 进行给药处理。细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中连续培养2周，直至出现肉眼可见克隆。弃去细胞培养基，PBS清洗后，4%多聚甲醛室温固定15 min，0.1%结晶紫染液染色1 h，流水缓慢洗去染液，空气干燥。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 0.25%胰酶液消化AGS细胞，新鲜培养基重悬细胞，制成单细胞悬液。接种2 ml AGS细胞悬液于6孔板中，每孔细胞数 5×105个，将细胞随机分为对照组、黄芪甲苷IV组、紫杉醇组和联合组，按照 “1.4”项下进行给药处理。细胞置入37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h。收集AGS细胞，预冷PBS清洗细胞。加入200 μl的Annexin V-FITC结合液重悬细胞，5 μl的Annexin V-FITC混匀，加入10 μl的PI混匀，室温避光反应20 min，立即上流式细胞仪检测。

1.7 Western blot检测Bax、Bcl-2和STAT3-NF-κB途径相关蛋白的表达 0.25%胰酶液消化AGS细胞，新鲜培养基重悬细胞，制成单细胞悬液。接种2 ml AGS细胞悬液于6孔板中，每孔4×105个细胞。继续培养细胞12 h后，弃去旧培养基，更换新鲜培养基。按照“1.4”项下进行分组给药处理，24 h后收集细胞。裂解液裂解细胞，收集上清液，测定每个蛋白样品的蛋白浓度。每组各取30 μg蛋白加入SDS-PAGE凝胶加样孔内电泳分离，随后将蛋白转至PVDF膜上。封闭液室温封闭2 h，Bax抗体稀释液(1∶500)、Bcl-2抗体稀释液(1∶500)、STAT3抗体稀释液(1∶2 000)、NF-κB抗体稀释液(1∶2 000)、pSTAT3抗体稀释液(1∶2 000)、pNF-κB抗体稀释液(1∶2 000)和GAPDH抗体稀释液(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。超敏ECL发光液显色，暗室曝光。

1.8 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 消化对数期生长的AGS细胞，无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×105个/ml。取100 μl细胞悬液加入Transwell小室中，另取600 μl含20% FBS的Ham′s F-12培养基加入下室中，按照“1.4”项下对细胞进行分组给药处理，细胞在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。取出小室，弃去培养基，甲醛固定30 min，风干。0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下观察、记数。以上为迁移实验步骤。

进行侵袭实验前，将Transwell小室用Matrigel包被，待Matrigel凝固后，接种AGS细胞于有Matrigel包被的小室中，其余步骤与迁移实验步骤相同。细胞在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h。取出小室，弃去培养基，甲醛固定30 min，风干。0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下观察、记数。

2 结果

2.1 黄芪甲苷IV及紫杉醇对胃癌细胞使用浓度筛选 与0 μg/ml组相比，黄芪甲苷IV 5 μg/ml组和10 μg/ml组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)，黄芪甲苷IV 20 μg/ml组、40 μg/ml组、80 μg/ml组和160 μg/ml组细胞活力明显降低(P<0.05)。黄芪甲苷IV IC50=63.99 μg/ml，此为后续实验中黄芪甲苷IV的使用浓度。见图1。

图1 黄芪甲苷IV及紫杉醇对胃癌细胞使用浓度的筛选

与0 μg/ml组相比，紫杉醇 5 μg/ml组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)，紫杉醇10 μg/ml组、20 μg/ml组、40 μg/ml组、80 μg/ml组和160 μg/ml组细胞活力明显降低(P<0.05)。紫杉醇IC50=40.08 μg/ml，此为后续实验中紫杉醇的使用浓度。见图1。

2.2 黄芪甲苷Ⅳ联合紫杉醇抑制胃癌细胞增殖 与对照组相比，黄芪甲苷Ⅳ组、紫杉醇组和联合组的细胞活力明显降低(P<0.05)；与联合组比较，黄芪甲苷Ⅳ组和紫杉醇组的细胞活力明显升高(P<0.05)。此外，与对照组相比，黄芪甲苷Ⅳ组、紫杉醇组和联合组的细胞克隆形成数明显降低(P<0.05)；与联合组比较，黄芪甲苷Ⅳ组和紫杉醇组的克隆形成数明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 黄芪甲苷IV联合紫杉醇抑制胃癌细胞增殖

2.3 黄芪甲苷Ⅳ联合紫杉醇诱导胃癌细胞凋亡 与对照组相比，黄芪甲苷Ⅳ组、紫杉醇组和联合组的细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，细胞Bax蛋白表达明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)；与联合组相比，黄芪甲苷Ⅳ组和紫杉醇组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，细胞Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图3。

图3 黄芪甲苷IV联合紫杉醇诱导胃癌细胞凋亡

2.4 黄芪甲苷Ⅳ联合紫杉醇抑制胃癌细胞迁移和侵袭 与对照组相比，黄芪甲苷Ⅳ组、紫杉醇组和联合组的细胞迁移和侵袭数明显降低(P<0.05)；与联合组比较，黄芪甲苷Ⅳ组和紫杉醇组的细胞迁移和侵袭数明显升高(P<0.05)。见图4。

图4 黄芪甲苷IV联合紫杉醇抑制胃癌细胞迁移和侵袭(200×)

2.5 黄芪甲苷Ⅳ联合紫杉醇抑制胃癌细胞STAT3-NF-κB途径活化 与对照组相比，黄芪甲苷Ⅳ组、紫杉醇组和联合组细胞中pSTAT3/ STAT3和pNF-κB/NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.05)；与联合组相比，黄芪甲苷Ⅳ组和紫杉醇组细胞中pSTAT3/STAT3和pNF-κB/NF-κB蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图5。

图5 黄芪甲苷IV联合紫杉醇抑制胃癌细胞STAT3-NF-κB途径活化

3 讨论

根治性胃切除术仍是目前治疗胃癌的主要方法。然而，即使经过根治性手术和充分的淋巴结切除术，进展期胃癌患者的生存率仍然很低[9]。因此，探索和优化治疗策略对提高胃癌患者的生存效益至关重要。本研究应用黄芪甲苷Ⅳ和紫杉醇处理胃癌细胞，结果发现，黄芪甲苷Ⅳ、紫杉醇和两者联合用药均可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。此外，两者联合用药比单一用药对胃癌细胞的作用更为明显。

研究表明，黄芪甲苷Ⅳ可诱导肝癌细胞的细胞毒作用和外源性/内源性凋亡效应，还可引起肝癌细胞周期阻滞，降低肝癌细胞抗凋亡蛋白的表达，并抑制肝癌细胞的侵袭能力[10]。黄芪甲苷Ⅳ除了参与调节癌细胞生物学行为外，在调节癌症耐药方面也发挥重要作用。黄芪甲苷Ⅳ通过抑制内质网应激和自噬增加非小细胞肺癌细胞对顺铂的化疗敏感性，抑制细胞活力，促进细胞凋亡[11]。紫杉醇由于其广谱的抗肿瘤活性成为治疗多种晚期和难治性癌症最有效的抗肿瘤药物之一。但紫杉醇产生的显著副作用限制了其作为抗癌药物的最佳临床效用。因此，紫杉醇联合用药成为了研究者们的关注重点之一。

在肿瘤微环境中，STAT3-NF-κB通路在基质细胞和肿瘤干细胞中被结构性激活。STAT3-NF-κB通路的激活可促进肿瘤的生长，促进肿瘤干细胞标志物的表达和侵袭力，增强肿瘤细胞对顺铂的耐药性[12]。除了在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和免疫抑制中的作用外，STAT3-NF-κB途径还通过调节microRNAs表达、肿瘤干细胞维持和肿瘤转移前微环境促进癌症的进展[13]。研究表明，二甲双胍通过抑制STAT3-NF-κB的激活抑制IL-6诱导的乳腺癌细胞上皮-间质转化、细胞增殖和迁移[14]。异甘草苷元是从甘草中提取的一种天然黄酮类化合物，通过ROS介导的STAT3-NF-κB信号通路的抑制，诱导肝癌细胞凋亡[15]。从以上的研究成果不难看出，STAT3-NF-κB信号通路可能是治疗肿瘤的潜在靶点之一。本实验结果显示，pSTAT3/STAT3和pNF-κB/NF-κB蛋白表达明显降低，说明黄芪甲苷IV、紫杉醇处理胃癌细胞，可导致STAT3和NF-κB磷酸化水平下降，STAT3-NF-κB信号通路受到抑制。此外，两者联合用药比单一用药对胃癌细胞STAT3-NF-κB信号通路的抑制作用更为明显。

综上所述，黄芪甲苷Ⅳ联合紫杉醇可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。该作用可能是通过抑制STAT3-NF-κB信号通路实现的。