肾上腺嗜铬细胞瘤一家系中的MAX基因p.R66X突变

韦学成 雷思羽 何屹*

作者单位： 314000 浙江中医药大学嘉兴学院联培基地（韦学成）314000 浙江省嘉兴市第一医院（雷思羽 何屹）

嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma，PHEO）是起源于肾上腺髓质嗜铬细胞的肿瘤，通过分泌、合成大量儿茶酚胺而引起以高血压、高代谢、高血糖等一系列临床症状。其中遗传性PHEO 为常染色体显性遗传疾病，具有高度外显性。在临床上尽早了解患者在PHEO 方面的潜在风险因素，对此种疾病的诊治及预后有着至关重要的意义。本研究笔者回顾性分析1 个PHEO 家系患者的临床诊治资料，对患者及其家系进行相关突变基因检测，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2005 年12 月至2021 年5 月在嘉兴市第一医院泌尿外科收治及临床随访的1 个汉族PHEO 家系（见图1），进行了详细的家系调查、相关辅助检查及相关突变基因检测。患者（II1），男，首诊年龄24 岁。（1）2005 年12 月因“血压升高2 年余，体检发现右肾上腺肿瘤2 周”于本院诊治，B 超、CT 检查示“右侧肾上腺占位”，排除禁忌后行“腹腔镜下右肾上腺肿瘤切除术”。病理诊断：嗜铬细胞瘤。（2）2016 年11 月因体检发现“右侧甲状腺结节”于本院诊治。B 超显示右侧甲状腺中上极偏外侧1.0 cm×0.7 cm×0.4cm 低回声区，边界欠清，形态欠规则。全麻下行右侧甲状腺全切+右颈部淋巴结清扫术。病理诊断：亚急性甲状腺炎。（3）2017 年8 月因体检发现“左侧肾上腺占位”入住本院。入院血压值为123/84 mmHg，去甲肾上腺素2,766.00 ng/L（正常值：0～600 ng/L），肾上腺素、血清钾、ACTH 促肾上腺皮质激素（4PM、8PM）、醛固酮（立卧位）、高血压三项（立卧位）、血皮质醇（4PM、8AM）等均在正常范围内。肿瘤相关物质未见明显异常。计算机断层扫描（computer tomography，CT）检查示左肾上腺3.8 cm×2.9 cm 占位。甲状腺B 超提示甲状腺右叶切除术后，左叶未见明显肿大及占位。其余入院常规检验检查未见明显异常。经α 受体阻滞剂盐酸酚苄明降压和扩容治疗后，行腹腔镜下左侧肾上腺PHEO 切除术。术中血压保持平稳，离断肿瘤瘤体时没有发生难以调控的低血压。病理诊断：嗜铬细胞瘤（图2B），免疫组化：CGA（+），Syn（+），Inhibin（+，皮质），Calretinin（+，皮质），S-100（+），Ki67（+，1%），CK（-），Vinmentin（+），PAX-8（-），EMA（-），CD31（+，血管）。术后血压116/70 mmHg。2017 年9 月对其家族成员进行MAX 基因检测，发现无症状1 例MAX 基因突变携带者：患者儿子（III1），当时10 岁。当时测血压正常，去甲肾上腺素、肾上腺素、血清钾、血皮质醇（4PM、8AM）、促肾上腺皮质激素（4PM、8PM）、醛固酮（立卧位）等均在正常范围内。肿瘤相关物质未见明显异常。CT 检查示双侧肾上腺未见明显异常。甲状腺B 超提示双侧甲状腺未见明显肿大及占位。建议积极随访观察，以便及时处理。

1.2 MAX 基因检测方法 本研究经本院医院伦理委员会批准，参与者知情同意。抽取该家族所有5 位家族成员（患者包括在内）的外周血5 mL，DNA 的提取、MAX 基因的PCR 扩增、鉴定、纯化和直接测序，引物序列及实验步骤参照文献［1-2］。解读数据的规则依据美国医学遗传学和基因组学学院（american college of medical genetics and genomics，ACMG）相关指南。变异命名参照HGVS 建议的规则给出（http：//www.hgvs.org/mutnomen/）。基因检测列表。

1.3 其他检查 影像学检查和临床生化指标检测。影像学检查包括肾上腺和甲状腺B 超/CT 检查等。临床生化指标检测血儿茶酚胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、血清钾、促肾上腺皮质激素（4PM、8PM）、醛固酮（立卧位）、高血压三项（立卧位）、血皮质醇（4PM、8AM）等。

2 结果

2.1 家系调查及临床特点 患者父亲（I1），母亲（I2），患者（II1）、配偶（II2）及儿子（III1）分别64 岁、63 岁、39 岁、38 岁和13 岁，均无PHEO 的临床、生化和相关影像学检查的异常表现。患者（II1），39 岁，现在随访中。患者二次术后血压、肾上腺CT、甲状腺B 超、儿茶酚胺等未见明显异常。患者儿子（III1），现13 岁，现在随访中。血压、B 超、CT、儿茶酚胺等均未见明显异常。

2.2 基因检测结果 5 位家系成员中有2 例（II1、III1）存在MAX 基因（NM_145112）第3 外显子（Exon 3）第196 位点c.196C＞T，p. R66 杂合无义突变，与临床相符，为常染色体显性遗传，该突变会导致编码蛋白序列提前终止，产生截短蛋白或被降解。在1000 Genomes 数据库中未见频率报道。其余3 名家系成员既无MAX 基因突变，也无PHEO 的临床、生化和相关影像学检查的异常表现。

3 讨论

PHEO 起源于肾上腺髓质嗜铬细胞，而起源于肾上腺外的交感神经和副交感神经的副神经节上的嗜铬细胞的肿瘤被称为副神经节瘤（paraganglioma，PGL）。肾上腺PHEO 约占90%，PGL 约占10%。PHEO 临床上多散发，也可表现为遗传相关。随着基因组学研究的逐步开展，越来越多遗传易感基因随之发现，目前发现遗传性PHEO 约占全部PHEO 的30%［3-4］。其中，家族性PHEO是遗传性PHEO中一种常染色体显性遗传的特殊类型，约占6%～10%［5］。

目前PHEO 病因尚不明确，可能与种系基因突变密切有关，且存在遗传倾向，随着对于PHEO 发病中的遗传机制研究有了一个更加深入的认知，已发现多种导致PHEO 发生的致病基因突变，分别为RET、VHL、NF1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SDHAF2、KIF1B、HIF2A、TMEM127、PHD1/2、FH、MAX 和MDH2 等［6-7］。自2002 年至今，全球数个研究组陆续对散发的嗜铬细胞瘤患者进行遗传致病基因的突变筛查，通过分析得到SDHB、SDHD、VHL 和RET 4 个基因携带突变率最高。而RET、VHL、NF1、SDHD、SDHAF2 则表现出高度的家族遗传相关性。VHL、SDH、HIF2A 的基因突变主要与低氧反应相关，而RET、NF1、TMEM127 和MAX 主要涉及激酶信号通路，与RAS、PI3K-AKT 和mTOR 等常见下游信号分子相关［8］。

MAX 突变是新近研究发现的一个可能与PHEO 易感的相关因素，在PHEO/PGL 中约占1.12%［9］。MAX基因包含5 个外显子，位于染色体14q23·3，MAX 编码的产物是一种碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loophelix zipper，bHLH）结构域的亮氨酸拉链蛋白，是MYCMAX-MAD 网络中的重要组成部分。MYC-MAX-MAD网络由一系列转录因子构成，它们之间的互相作用导致基因特异度的转录激活或抑制，在细胞增殖、分化和死亡中起着重要作用［10］。MAX 通常与原癌基因MYC形成二聚体，与特定E-box 基因序列结合，激活启动子，编码相关蛋白，促进细胞增殖、血管生成等。大鼠PHEO 细胞系PC12 在mRNA 和蛋白水平上均不表达MAX［11-12］，以此为研究对象，对PC12 引入MAX 基因后，细胞生长受到抑制，说明MAX 基因具有抑癌作用［13］，而MAX 的突变失活可能成为肿瘤发生的关键因素。在对多种神经源性肿瘤的研究中发现，截断的MAX 蛋白与MYC 信号的转录抑制受损有关［14］，换句话说，MAX 截断突变可能一定程度上增加了MYC 原癌基因的转录，因此发生致癌作用。PHEO 的发生发展与RAS-PI3K-AKT-mTOR 轴密切相关，RET［14］、NF1［15］、TMEM127［16］等基因突变发挥的致癌作用也与此相关。由于RAS-PI3K-AKT-mTOR 和MYC-MAX-MAD 网络之间存在交叉相关，因此，MYC 网络中央调节蛋白MAX 的改变也会导致PHEO 也就不足为奇，PHEO 中的MAX突变避免了MAX 对E-box 目标基因序列的转录抑制，从而引起了致瘤性MYC 的解除，从而引起了PHEO的发生。目前研究已发现20 余种MAX 基因突变，通常可分为截断突变（c.97C＞T、c.223C＞T 等）、错义突变（c.73C＞T、c.269G＞C 等）及未定义突变（c.18C＞T、c.414G＞A 等）［9］。本研究笔者发现c.196C＞T 截断突变位于第3 外显子，为国内首次报道。

此外，有研究表明，MAX 基因突变与恶性程度有关［9］。但是由于恶性标记知识有限，通常临床上只有发现肿瘤转移后才能诊断发现，因此往往缺乏有效且及时的治疗，成为PHEO 诊断和治疗的极大挑战。早前研究已发现SDHB 基因突变者具有高度恶性倾向［8］，而SDH 的其他亚型则没有，其中机制未明。此外，研究发现，MAX 基因突变可能也是引起PHEO 恶性程度增加的一个原因。MAX 突变与肿瘤转移行为有关，大约10%的MAX 突变病例出现转移［9］。但MAX 突变引起PHEO 恶性程度增加目前只是一个初步判断，参与PHEO/PGL 恶性转化的机制尚未阐明，还需进一步研究加以证实。

本研究通过对一肾上腺PHEO 家系的全基因组学分析，发现了一个新的致病性或可能致病的MAX 外显子基因变异。该家系中有2 例（患者II1 及其儿子III1）存在MAX 基因c.196C＞T，p.R66X 截断突变，且明显存在家族遗传倾向，并符合先前研究的父系遗传的特点，是迄今为止发现的又一个MAX 基因的新位点的突变。尽管本研究入选病例数较少，但不可否认，MAX 基因c.196C＞T 突变与PHEO 的发生发展存在密切关联。尽管该病例中患者未被发现有明确的PHEO 恶性转移征象，但由患者双侧、多发等一系列症状表明，该MAX 基因突变很大程度上可能存在不良生物学行为，上述变异可能存在致恶性PHEO 作用，因此，MAX 突变的早期发现对PHEO 患者及其家系的重要性不言而喻。通过基因检测可至少对30%的PHEO 种系基因突变的患者进行正确诊断，然后进行早期监测，从而更加及时和有效地进行治疗。因此，对p.R66X 突变者，10 岁起应每年检测血或尿3-甲氧基肾上腺素、3-甲氧基去甲肾上腺素及肾上腺影像学检查，监测可能发生的PHEO，有利于患者早期诊治。

综上所述，笔者研究发现一个MAX 基因的c.196C＞T，p.R66X 截断突变，为今后家族性PHEO 的识别提供相应指导，而且结果表明在高危患者及其家属中对MAX 及相关基因进行分子筛查并且早期干预是十分重要的，特别是双侧、多发PHEO/PGL 和混合去甲肾上腺素、肾上腺素表型的患者，早期的诊治可以有效预防各种心血管并发症。笔者期待通过外显子基因测序技术的不断发展和基因检测工作的逐步开展，对PHEO患者的诊断治疗和综合管理能够得到显著的改善。