β-伴大豆球蛋白中α、α′亚基对大豆分离蛋白薄膜微观结构和功能特性的影响

杨晓晴， 李佳芯， 吕 博， 付洪玲， 于寒松，*，宋 波， 刘珊珊

(1.吉林农业大学 食品科学与工程学院， 吉林 长春 130118； 2.国家大豆产业技术体系研发中心大豆加工研究室， 吉林 长春 130118； 3.东北农业大学 食品学院， 黑龙江 哈尔滨 150030；4.东北农业大学 农学院， 黑龙江 哈尔滨 150030)

石油基合成薄膜的广泛应用导致不可再生资源的严重消耗，以天然植物基原料生产可食性生物降解薄膜受到了食品行业的广泛关注。大豆中蛋白质含量高，大豆分离蛋白(soy protein isolate，SPI)原料充足，成本相对较低，且分离蛋白具有良好的成膜、可再生降解和易加工成型等优点，是制备可食性生物降解薄膜的潜在选择[1]。SPI主要由大豆7S球蛋白和大豆11S球蛋白组成，7S球蛋白主要有β-伴大豆球蛋白、γ-伴大豆球蛋白和碱性7S球蛋白3种组分。β-伴大豆球蛋白占大豆7S球蛋白的50%以上，是由α、α′和β亚基组成的一种寡聚蛋白[2]。由于β-伴大豆球蛋白中α亚基(72 kDa)与α′亚基(76 kDa)分子质量极其相似，科研人员通常将其作为共同研究对象探讨其与蛋白质功能性的关系。研究发现，当β-伴大豆球蛋白多个亚基缺失时，不仅可以有效去除致敏蛋白质，还能改善其氨基酸的组成及特征[3]。据报道，不同蛋白质的组成还影响着SPI的加工特性，包括热诱导可溶性聚集体的形成、凝胶性和成膜能力，蛋白质组成对薄膜性能的影响是目前国内外学者研究的重点[4]。郭宽等[5]研究了不同比例的11S和7S大豆蛋白的成膜特性，并证明了7S球蛋白含量高时薄膜具有更优异的断裂伸长率和透明度。Okamoto[6]报道了含有11S球蛋白的脂质膜的抗拉强度比对照脂质膜高2～3倍。然而，SPI薄膜的高亲水性和较弱的机械性能，限制了其在食品包装领域中的应用[7]，为了提高SPI包装薄膜的功能特性，人们已经对大豆蛋白薄膜的内部结构及功能特性进行了大量的研究，开发了各种技术改善SPI薄膜的水敏感性和机械性能，包括与其他可生物降解的聚合物混合、酶促交联、物理处理和化学交联，并将不同类型的SPI膜应用到食品，医药等领域[8-9]。

目前有关SPI薄膜的研究多数集中在SPI的蛋白浓度、受热环境等表观因素对薄膜性能的影响，尚未见到从亚基水平上探讨SPI分子结构和成膜特性的关系。以不同蛋白亚基缺失的大豆品种作为原料，探索SPI不同单个亚基及不同亚基组成与薄膜加工特性的构效关系，对于从分子水平上研究大豆蛋白质结构与加工特性尤其是成膜特性的关系具有重要意义。

本研究拟采用东农47(Wild对照)和3种不同亚基缺失型的大豆为原料提取SPI，制备不同亚基组成的SPI薄膜，并对薄膜的微观结构、流变特性、机械性能、水溶性、屏障特性、热稳定性、光学阻隔性进行研究，探讨亚基组成与成膜特性的关系，希望为提高亚基缺失型SPI薄膜的综合包装性能，为高成膜性大豆蛋白系列产品的开发提供理论依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用的4种大豆[东农 47(Wild)、α-lack、α′-lack、(α+α′)-lack]是具有中国大豆遗传背景的亚基缺失型原料，由东北农业大学大豆研究所大豆生物学教育部重点实验室刘珊珊教授团队提供；无水乙醇、丙酮、盐酸、硫酸、丙三醇、氢氧化钠，北京化工厂；考马斯亮蓝G- 250、丙烯酰胺、甲醇、去离子水，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；过硫酸铵，索莱宝科技有限公司；冰乙酸、硼酸，天津市光复科技发展有限公司；溴酚蓝、四甲基乙二胺、甲烷、双叉丙烯酰胺、β-巯基乙醇，美国Sigma公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TP型大豆脱皮机，山东省鲁曹高新机械制造有限公司；CS- 2000型高速多功能粉碎机，浙江省永康市天祺盛世工贸有限公司；JK- MSH- 2L型磁力搅拌仪，上海精学科学仪器有限公司；FDU- 7006型冷冻干燥仪，韩国OPERON公司；iBright CL1000型凝胶成像仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；ME204型分析天平、FE28型数显pH计，上海梅特勒- 托利多仪器有限公司；MCR302型流变仪，奥地利安东帕(中国)有限公司；VERTEX 70型红外光谱仪，德国Bruker公司；XRD- 7000S/L型X射线衍射仪，日本岛津企业管理有限公司；Sigma300型电子显微镜，卡尔蔡司(上海)管理有限公司；WDW- 200H型数显式电子拉力试验机，济南市凯德仪器有限公司；VICTOR NivoTM型荧光酶标仪，珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司；UV- Vis 1700型紫外- 可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；CR- 5型台式色彩色差仪，日本柯尼卡美能达控股公司。

1.3 实验方法

1.3.1不同亚基组成脱脂豆粉的制备

将不同亚基组成大豆进行脱脂处理。4种大豆经脱皮机去皮后用粉碎机粉碎成粉末，过60目筛得到脱皮豆粉。室温下，脱皮豆粉与丙酮溶液按1∶5比例混合(g/mL)，磁力搅拌0.5 h后静置1 h。将上清液吸出，重复实验数次，至上清液无色，吸出上清液后放在通风橱晾干，得到脱脂豆粉。

1.3.2不同亚基组成SPI的制备

SPI的制备参考Wang等[10]的碱溶酸沉法，并稍作修改。将脱脂豆粉与去离子水以1∶10(g/mL)的比例混合，用2 mol/L NaOH将豆粉分散体pH值调节至8.5，连续搅拌2 h，14 000 r/min、4 ℃，离心30 min，弃沉淀。用2 mol/L HCl调节上清液pH值至4.5，充分搅拌2 h，14 000 r/min、4 ℃，离心30 min，弃去上清液。收集沉淀，以1∶5(g/mL)的比例分散在水中，并用2 mol/L NaOH调节pH值至7.0，取上清液，4 ℃透析48 h(期间至少换水4次)。将完全透析后的蛋白溶液冷冻干燥，得到SPI，储存备用。4种SPI分别标记为：Wild、α-lack、α′-lack和(α+α′)-lack。

1.3.3SPI分子质量的测定

使用十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)对蛋白质分子质量进行分析。处理后的4种SPI样品上样量为10 μL，在由浓缩胶(质量分数5%)和分离胶(质量分数12%)组成的电泳系统上运行，操作电压最初设置为60 V，当样品进入分离胶后，电压改为90 V，直到电泳结束。从胶盒中取出凝胶，染色和脱色后拍照。

1.3.4SPI成膜液的制备

称取3 g SPI溶于100 mL水中，以获得质量分数为3%的SPI溶液，再加入1.5 g甘油，用2 mol/L NaOH调节膜液pH值至10.0，磁力搅拌30 min。将获得的膜液在90 ℃下水浴加热30 min(期间不停搅拌，使溶液均匀受热)，冷却至室温消泡，放在4 ℃下保存，待测。

1.3.5SPI成膜液流变特性的测定

使用装有平行板(直径25 mm，间隙1.0 mm)的流变仪进行流变特性测量。取1.5 mL成膜液，在固定温度(25 ℃)和剪应力(1.0%)条件下，以0.1～100.0 rad/s的变化频率测试1.5 mL成膜溶液的流变性。

1.3.6SPI薄膜的制备

采用溶液流延法，取一定量成膜液倒入有机玻璃槽(120 mm×80 mm×20 mm)中，在70 ℃鼓风干燥箱内干燥6 h，揭膜，放于相对湿度75%的室温环境下保存48 h，待测。

1.3.7SPI薄膜官能团结构的测定

采用红外光谱，以4 cm-1的分辨率从4 000 cm-1到400 cm-1对样品进行扫描，扫描次数为32次。使用Peak Fit(4.12)软件，利用二阶导数和多个高斯曲线拟合分析，计算二级结构相对含量。

1.3.8SPI薄膜晶型结构的测定

采用配备Cu- Kα辐射源的X-射线衍射仪测定冻干的蛋白薄膜样品的晶体结构。设置条件：λ为0.154 nm，衍射角2θ范围为5～40°，电流30 mA，电压40 kV，扫描速率为5°/min。

1.3.9SPI薄膜形貌的观察

将蛋白薄膜样品冷冻干燥后喷金处理，使用扫描电子显微镜观察薄膜的表面和断面形态，在加速电压为3～10 kV下操作。

1.3.10SPI薄膜机械性能的测定

参照GB/T 1040.3—2006测量薄膜的抗拉强度(tensile strength，TS)、断裂伸长率(elongation at break，EB)[11]。薄膜样品裁成均匀尺寸(12 mm×150 mm)的长条，初始夹距设为50 mm，拉伸速度10 mm/min。使用数字千分尺从10个不同位置测量薄膜厚度。

抗拉伸强度按式(1)计算，断裂伸长率按式(2)计算。

(1)

式(1)中：TS为抗拉伸强度，MPa；F为薄膜断裂时的最大承受力，N；D为膜的宽度，mm；S为薄膜的厚度，mm。

(2)

式(2)中：EB为断裂伸长率，%；L0为薄膜的初始长度，mm；L为薄膜断裂时距离标线的长度，mm。

1.3.11SPI薄膜耐水性的测定

1.3.11.1 水分含量的计算

水分含量测定参照Luo等[12]的操作方法并适当修改。准确称取适量薄膜样品(M1)，在105 ℃下干燥至恒重(M2)。水分含量(moisture content，MC)按式(3)计算。

(3)

1.3.11.2 水溶性的计算

将干燥的薄膜放入装有50 mL蒸馏水的烧杯中，在25 ℃下浸泡24 h。在3 000 r/min离心5 min，将不溶性的薄膜分离出来，105 ℃干燥至恒重并再次称重(M3)。水溶性(total soluble matter，TSM)按式(4)计算。

(4)

1.3.12SPI薄膜屏障特性的测定

1.3.12.1 水蒸气透过系数的计算

参照GB/T 1077—1988[13]测定薄膜的水蒸气透过率(water vapor permeability，WVP)，水蒸气透过系数按式(5)计算。

(5)

式(5)中：WVP为水蒸气透过系数，g·mm/(m2d·kPa)；Δm为t时间内水蒸气迁移量，g；L为薄膜厚度，mm；A为薄膜有效面积，m2；t为测量时间，d；Δp为两侧压力差，kPa。

1.3.12.2 氧气透过系数的测定

参考GB/T 1038—2000[14]，采用薄膜透氧测试仪进行薄膜氧气透过系数(oxygen permeability，OP)的测定。

1.3.13SPI薄膜热力学特性的测定

将大豆蛋白薄膜通过液氮淬断后研磨成粉末，采用热失重分析仪对样品进行温度- 质量曲线和温度- 质量导数曲线分析。热失重分析扫描范围为30～700 ℃，加热速率为10 ℃/min，氮气流速为10 mL/min，实验样品质量为5～10 mg。

1.3.14SPI薄膜光学性能的测定

1.3.14.1 比色参数的计算

使用色差仪测量膜的表面颜色(L*、a*和b*)。用标准白板(L=99.28、a=-0.04和b=-0.31)作为背景对照。总色差(ΔE)按式(6)计算。

(6)

1.3.14.2 紫外光谱的测定

使用紫外- 可见分光光度计在200～800 nm波长下，以空气作为参考，测量薄膜样品(10 mm×40 mm)的透射率。

1.4 数据处理

每组实验均重复3次，所有数据以平均值±标准差表示。使用IBM SPSS Statistics 26软件对实验数据进行处理；应用Duncan’s法进行显著性分析，P<0.05为差异显著；采用Origin 8.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同亚基组成对SPI分子质量的影响

采用Image Lab 5.2.1软件分析4种SPI的SDS- PAGE图谱，结果如图1。由图1可知，在不同种类的SPI对应的蛋白质条带组成中，Wild型SPI中β-伴大豆球蛋白由α′、α和β三个亚基组成，分别对应在75、70、50 kDa左右的条带；而在α亚基缺失型、α′亚基缺失型和(α+α′)双缺失型的SPI中，通过SDS- PAGE图谱的观察，基本检测不出α亚基、α′亚基和(α+α′)亚基的条带，4种SPI的特征频带与前人的研究结论一致[15]。由此确定SPI的亚基缺失，并对各亚基的含量进行分析，表明SPI具有稳定的遗传特性，满足实验设计的要求。

2.2 不同亚基组成对SPI成膜溶液流变性能的影响

图2 不同亚基组成对薄膜流变学特性的影响Fig.2 Effect of different subunit compositions on rheological properties of films

动态流变学研究被认为是表征聚合物形态结构的有效方法。一般用储能模量(弹性模量，G′)和损耗模量(黏性模量，G″)来反映薄膜材料的流变学行为。为探讨不同亚基缺失对SPI薄膜的动态流变特性影响，本实验采用流变仪对成膜溶液的流变行为进行研究，不同亚基组成SPI薄膜黏弹性模量和复数黏度随频率变化结果如图2。由图2可知，在相同的剪切频率(0～100 rad/s)下，所有样品的G′值均大于G″值，并且所有样品的G′和G″值与角频率呈正相关，表明所有成膜溶液的弹性行为明显高于黏性行为，表现出更多的类似固体的结构[16]。α′-lack成膜液的G′值均高于Wild型、α-lack和(α+α′)-lack成膜液的G′值，而α-lack的G′值虽然也随着角频率的增大而增加，但其具有最小的G′值和增长速率，说明α′亚基缺失可以促进成膜凝胶化的强度，从而形成紧密结构。α亚基缺失会降低成膜渗液的G′，从而减弱成膜凝胶化的强度。由此可见，所有成膜溶液体系都表现出弹性液体的流变学行为。成膜溶液的复数黏度(η*)在0.1～1.0 rad/s的角频率下骤降，随即趋于稳定，而后在10.0～100.0 rad/s的角频率下，η*又逐渐增大，说明η*对角频率具有一定的依赖性。这种现象可能是由于成膜液经过一段反应时间后，在静止状态下蛋白质分子链相互联结缠绕，在低频剪切力作用下，蛋白质分子链被解开，内部分子或质点被重新排列成线，溶液流层间的作用力减小，黏度降低。随着角频率不断增大，蛋白质内部有序排列再次改变，此刻蛋白质分子间聚集程度不断增加，蛋白质分子间的相互作用力增强，黏度增大，使膜液表现为黏性流体[17]，证明SPI成膜溶液可以形成连续的网络结构。成膜溶液中α′-lack的G′大于α-lack的G′，α′-lack的G″小于α-lack的G″，α′-lack溶液的复数黏度曲线增加趋势最为明显，说明α′-lack的成膜液具有更好的潜在成膜能力。在一定程度上，亚基缺失所导致的蛋白质结构的差异影响了SPI成膜溶液的流变学特性。

2.3 不同亚基组成对SPI薄膜结构特性的影响

2.3.1对薄膜二级结构的影响

表1 SPI薄膜二级结构含量比例变化Tab.1 Changes in proportion of secondary structure content of SPI films %

数值=平均值±标准差(n=3)，同列不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.3.2对薄膜晶型结构的影响

X射线衍射常用于检测蛋白质等生物大分子的无定型和晶型结构[20]，不同亚基组成SPI薄膜X射线衍射分析结果如图4。由图4可知，对照组Wild薄膜在21.2°出现的衍射峰代表了SPI中β-折叠的二级构象，并且较宽的峰形说明了非晶态球蛋白(7S和11S)是SPI成膜中重要组成部分，且薄膜具有无定形特性[21]。α-lack、(α+α′)-lack薄膜与21.2°处Wild薄膜衍射峰型相似，而α′-lack薄膜的峰型发生了明显的变化且衍射峰向左偏移至2θ为21.1°，宽度逐渐减小，强度逐渐增加，说明α′亚基缺失在一定程度上可以影响SPI膜的晶体结构。大豆分离蛋白具有四级球形结构，其中α螺旋和β折叠构成了SPI的次级结构。次级结构主要被其内部主链上形成的氨键所稳定[22]，α′亚基缺失改变了SPI分子中的次级键——氨键，将原来的次级结构变得更加紧凑、有序，使α′-lack的蛋白质分子和甘油之间形成作用应力的交联程度增加，限制了SPI分子链的自身活动，使薄膜结晶度降低[23]，这一结果进一步验证了红外光谱的分析结果。同时相较于对照组，(α+α′)-lack薄膜在9.3°出现了较明显的衍射峰，这是因为α、α′双亚基缺失时蛋白质在成膜过程中发生聚集，导致其分布不均匀，结晶度升高[24]。

图4 不同亚基组成SPI薄膜的X-射线衍射图Fig.4 X-ray diffraction analysis of SPI films composed of different subunits

2.3.3对薄膜微观结构的影响

扫描电镜图可以反映薄膜干燥过程中内部组分的相互作用以及表面结构特征，不同亚基组成SPI薄膜表面和断面的微观结构如图5。由图5可知： Wild薄膜是成片型的基质状态，断面出现的垂直裂纹是液氮淬断造成的；α-lack薄膜稍有微孔气泡出现；(α+α′)-lack薄膜表面出现了明显的裂纹，纹理杂乱无规律，并且表面及断面都出现了气孔较多的现象，说明α和α′双亚基缺失会导致成膜体系相容性较差；α′-lack薄膜表面平整且致密、裂隙少、无明显孔洞，呈有序波浪纹结构，断面也是相对紧密光滑的状态，说明α′亚基缺失会使SPI薄膜内部氢键相互作用力加强，进而网状交联程度增加，提高了薄膜的均匀性和致密性[25]，薄膜表现出优异的、均匀致密的微观结构可以提高消费者的接受能力，有利于后期在食品包装中进一步的应用。

上排图片放大倍数为5 000倍，下排图片放大倍数为300倍。图5 不同亚基组成SPI薄膜的扫描电镜分析结果Fig.5 Results of scanning electron micrographs of SPI films composed of different subunits

2.4 不同亚基组成对SPI薄膜功能特性的影响

2.4.1对薄膜机械性能的影响

图6 不同亚基组成对SPI薄膜机械性能的影响Fig.6 Effect of different subunit compositions on mechanical properties of SPI films

食品包装材料需要具备足够优秀的机械强度才能在运输或贮藏过程中保证食品的完整性，因此薄膜材料的机械性能是决定其是否具有潜在工业生产应用价值的主要因素。蛋白薄膜的机械性能包括抗拉伸强度(tensile strength，TS)和断裂伸长率(elongation at break，EB)，蛋白质组成成分和内部结构也会影响薄膜的机械强度[6]。不同亚基组成SPI薄膜机械性能分析结果见图6。由图6可知，β-伴大豆球蛋白中不同亚基组成对SPI薄膜的机械性能有显著的影响(P<0.05)。与Wild薄膜相比，α′-lack薄膜的TS提高了40%，而α-lack和(α+α′)-lack的TS分别为1.73 MPa和1.6 MPa，明显低于Wild薄膜。α-lack、α′-lack薄膜的断裂伸长率均低于对照组，表明薄膜柔韧性下降，连续紧密的薄膜结构可能限制了基材的分子运动，因此导致柔性降低[26]。出现这种情况可能是因为β-伴大豆球蛋白中α′亚基的缺失增强了SPI薄膜内部的化学交联程度，使大豆蛋白分子间作用力增强，并且有效地增加了蛋白质分子链间的联系，使分子链难以发生相对滑移，薄膜不易发生大的形变，保证了较好的力学性能，从而增加薄膜材料的机械强度；而α亚基缺失则会降低成膜强度，这与2.2中SPI成膜溶液流变特性的分析结果相符；(α+α′)-lack薄膜可能与自身微观结构中不均匀空腔的存在导致了抗拉伸强度的下降。Poysa等[27]研究7S球蛋白凝胶硬度时也有类似发现，相对于完整的7S球蛋白，缺乏β-伴大豆球蛋白的α′亚基会增加凝胶硬度。

2.4.2对薄膜耐水性的影响

食品包装薄膜在实际应用时多面临环境潮湿的问题，考察其水分含量和水溶性是非常重要的[28]，不同亚基组成SPI薄膜的水分含量和水溶性分析结果见表2。由表2可知，Wild薄膜由于其高含量的非极性氨基酸表现出高水溶性(36.53%)，而α′-lack薄膜的水溶性为30.81%，与前者相比，α′-lack薄膜的耐水性明显提高(P<0.05)，表明了α′亚基缺失增强了薄膜中分子间的相互作用，在热诱导作用下，形成的大分子蛋白质的水溶性低和溶于水的小分子蛋白质减少，新形成的共价网络结构更加牢固进而减弱了薄膜在水中的溶解[29]。水分含量分析结果显示，与Wild薄膜相比，α′-lack薄膜含水量较低，说明薄膜内部网络结构紧凑，薄膜水分含量的高低将直接影响其机械性能和阻水性，这也是α′-lack薄膜抗拉伸强度大的原因。Erdem等[30]对SPI复合薄膜的研究也表明，水溶性受成膜材料亲水性的影响，与蛋白质网络结构的密度有关。

表2 不同亚基组成的SPI薄膜的水分含量和水溶性Tab.2 Moisture content and water solubility of SPI films composed of different subunits %

2.4.3对薄膜屏障特性的影响

图8 不同亚基组成对SPI薄膜热稳定性的影响Fig.8 Effect of different subunit compositions on thermal stability of SPI films

水蒸气和氧气的渗透性通常是衡量包装薄膜质量的重要指标，薄膜低渗透性可以延缓新鲜产品的脱水率，另外，它可以减少某些食物成分(如多不饱和脂肪)的氧化，以延长食品的保质期[31]。不同亚基组成SPI薄膜屏障特性分析结果如图7。由图7可知，相比于Wild薄膜，不同亚基组成的薄膜水蒸气透过性均表现出显著下降的趋势(P<0.05)。α-lack薄膜的水蒸气透过系数为31.30 g·mm/(m2d·kPa)，而α′-lack薄膜的水蒸气透过系数较Wild薄膜降低了47%，为21.89 g·mm/(m2d·kPa)。透氧性也表现出类似趋势，说明α′-lack比α-lack具有更优异的屏障特性。这种情况可能有两方面原因：一方面，在Wild薄膜中存在很多水结合位点，而α′-lack薄膜中，α′亚基缺失增强了分子间相互作用，形成的氢键降低了SPI膜上水结合位点的数量[32]；另一方面，从扫描电镜图可以看出，α′-lack薄膜表面更加致密，内部间隙减少，阻碍了水分子的通过，这显著降低了水分子在SPI内部的扩散速率。

图7 不同亚基组成对SPI薄膜屏障性能的影响Fig.7 Effect of different subunit compositions on the barrier properties of SPI films

2.4.4对薄膜热稳定性影响

对SPI薄膜的热学性能进行表征，不仅可以检测膜结构发生的变化，还能获取膜结构中的水合作用以及稳定性等相关信息[33]。4种大豆蛋白薄膜热失重(TG)分析曲线和导数热重(DTG)分析结果如图8。由图8(a)可知，所有SPI薄膜均有3个阶段的热损失，随着温度从室温加热到100 ℃左右，所有的样品薄膜均有大约10%的质量损失，之后曲线趋于平缓。这主要是因为SPI薄膜亲水携带的水分和残余溶剂受热挥发导致的质量下降，此时存在的失重水分子主要是以物理吸附和弱氢键结合在大豆蛋白分子上[34]。第二个热降解阶段是从130～210 ℃，主要是小分子增塑剂甘油的蒸发，此阶段(α+α′)-lack薄膜显示出最大的质量损失(14.86%)，这是因为α、α′双亚基缺失改变的蛋白结构，形成的间隙远大于其他种类的薄膜(SEM结果保持一致)，使甘油更容易被挥发出去。第三阶段是温度大于230 ℃时4种不同亚基组成SPI开始热分解的阶段，此时Wild薄膜的质量损失了85.42%，(α+α′)-lack薄膜损失了90%，而α′-lack薄膜的质量只损失了83.83%。结合图8(b)的DTG图中可以看出，与其他3种薄膜相比，α′-lack薄膜有着更高的质量残余量，在α′亚基缺失的影响下，蛋白质分子更好地呈现线性并发生热交联，因此具有更高的热稳定性。

2.4.5对薄膜光学特性的影响

2.4.5.1 对薄膜色度的影响

不同亚基组成SPI薄膜的比色参数计算结果见表3。由表3可知，Wild薄膜具有最高的L*值(亮度)、a*值(绿度)和b*值(黄度)，ΔE(色差)最低。相比之下，α′-lack薄膜的a*值下降到-1.47，b*值下降到-0.58，这是由于a′亚基的缺失使薄膜内部结构发生改变，蛋白质聚集所导致的结果。ΔE随着β-伴大豆球蛋白中亚基的缺失而增大，这一结果与薄膜的色度数据一致，实验结果表明薄膜颜色变得更加鲜艳。(α+α′)-lack薄膜的ΔE最大，这是因为α和α′双亚基缺失使SPI的溶解性相对较弱，导致其在薄膜基质中无序且不均匀分布，Wu等[35]也发现了，β亚基(α、α′双亚基缺失)能促进热聚集程度优于α和α′亚基，进而降低蛋白的溶解度。本研究表明，薄膜不均匀分布使色差偏大，这一结果与薄膜的微观结构分析结果相对应，说明α和α′双亚基缺失会降低成膜溶解相容性，影响了薄膜的色度。

2.4.5.2 对薄膜透射率的影响

紫外线照射可能会造成感光性食品出现氧化、营养损失和脱味等质量问题，因此紫外线阻隔性能是评估食品包装材料性能一项重要指标。不同亚基缺失型薄膜的紫外- 可见透射光谱分析结果如图9。由图9可知，所有薄膜在200～300 nm的透射率均接近于0，SPI的这种特性归因于蛋白质的芳香族氨基酸对紫外线辐射的吸收[36]。在300～800 nm的可见光区域，α-lack薄膜透射率与Wild薄膜相比无明显差异，可见α亚基缺失不会提升SPI薄膜的光学性能；而α′-lack和(α+α′)-lack薄膜的光学阻隔性能都显著优于Wild薄膜，说明α′亚基缺失可以降低薄膜的光学透射率，提升其阻隔效果。不同亚基组成的薄膜都呈现半透明状，在透明食品包装中的应用潜力巨大。

图9 不同亚基组成对SPI薄膜透射率的影响Fig.9 Effect of different subunit compositions on transmittance of SPI films

3 结 论

本研究以东农47(Wild)、α亚基缺失型(α-lack)、α′亚基缺失型(α′-lack)以及α、α′双亚基缺失型[(α+α′)-lack]4种不同蛋白亚基组成大豆为原料提取SPI，利用溶液流延法制备蛋白薄膜，研究α、α′亚基对大豆分离蛋白成膜特性的影响。通过红外光谱、X-射线衍射等蛋白质结构分析方法发现，不同亚基组成会影响SPI薄膜二级结构的变化，α′亚基缺失使β折叠含量下降，α螺旋和无规则卷曲含量增加；同时α′亚基缺失增强了蛋白质分子间氢键的相互作用，内部网状交联程度增加，提高了薄膜微观结构的均匀性和致密性。β-伴大豆球蛋白中不同亚基组成对薄膜结构的影响会导致其功能特性的差异，对SPI薄膜的功能特性分析结果表明：α亚基缺失抑制了SPI成膜能力，降低了薄膜机械强度；α、α′双亚基缺失使SPI薄膜出现明显的缝隙和空腔结构，降低了成膜体系的相容性；α′亚基缺失提高了薄膜的抗拉伸强度，降低了水分含量和水蒸气透过性。与其他3种SPI薄膜相比，α′-lack薄膜表现出低吸水性、较强的屏障特性，最高热稳定性以及优秀的机械强度和光学性能。本研究通过探索亚基缺失型大豆分离蛋白薄膜结构与物性特征之间的关系，发现在一定程度上，α′亚基的缺失会改善大豆蛋白薄膜的结构性能。在证明了分离蛋白中α′亚基的缺失对SPI成膜有重要影响后，可以单独对特定亚基缺失型大豆品种进行繁育和栽培，作为大豆SPI薄膜的专用加工品种，为产品品质提升奠定基础。