小花杜鹃中两个新的木脂素

范贤哲，朱阳利，袁荣文，邓 丽，伍念荣，张立军，廖海兵*

1广西师范大学化学与药学学院 省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室，桂林 541004； 2广西桂林锐德检测认证技术有限公司，桂林 541100

小花杜鹃(Rhododendronminutiflorum)又名细花杜鹃、细榴花，为杜鹃花科杜鹃属(RhododendronL.)植物，常生于海拔1 120～1 430 m的丘陵地区，主产于我国广西和广东两个省份[1]。该属中的多种植物均有较高的药用和经济价值，如羊踯躅(R.molle)具有抗炎镇痛的药理作用，可用于风湿性关节炎、心血管等疾症的治疗[2]；烈香杜鹃(R.athopogonoide)为常用藏药，具有止咳平喘、清热解毒之功效[3]。随着现代色谱分离和波谱技术的快速发展，国内外对杜鹃属植物的化学成分和药理活性的研究正在不断深入和系统化。近年来从该属植物中分离得到了许多结构新颖、活性优良的化学成分，主要结构类型包括：香豆素、木脂素、黄酮和萜类等[4，5]，许多化合物表现出显著的降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗菌、杀虫以及抗氧化等生物活性[6,7]。

杜鹃属植物的降血糖活性一直以来备受国内外研究者的关注。Choi等[8]从R.brachycarpum中分离得到的rhododendric acid A和熊果酸对胰岛素信号转导关键酶PTP1B具有较强的抑制活性，其IC50值分别为6.3±0.6、3.1±0.3 μM。Liao等[5]从R.capitatum中分离出一对具有PTP1B抑制活性的对映异构体(-)-rhodonoids B和(+)-rhodonoids B，其IC50值分别为43.56±8.53、30.38±13.41 μM。从R.arboreum中分离得到的3-O-acetylursolic acid对α-葡萄糖苷酶表现出明显的抑制活性，IC50值为3.3±0.1 μM[9]。Muhammad等[10]发现R.schlippenbachii树皮80%甲醇粗提物的乙酸乙酯和二氯甲烷萃取部位可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性和降低小鼠体内的血糖浓度。

小花杜鹃隶属杜鹃属植物，目前国内外有关小花杜鹃的化学成分和药理活性的研究尚未见报道。鉴于此，本文对小花杜鹃95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位进行化学成分研究并对所分离得到的单体化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，以期为小花杜鹃的进一步开发和利用提供参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

JASCO P-2000型圆二色光谱仪(JASCO日本分光株式会社)；PerkinElmer Spectrum Two FT-IR红外光谱仪(美国珀金埃尔默股份有限公司)；Synergy H1全功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；Bruker-AVANCE400 NMR及600 NMR核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；Agilent 6545 Q-TOF液质联用系统和Cary 100型紫外可见分光光度计(安捷伦科技(中国)有限公司)；Shimadzu LC-20AT型高效液相色谱仪(Shimadzu公司)；P3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)；分析型C18色谱柱：5 μm，150 mm×4.6 mm及制备型C18色谱柱：5 μm，250 mm×20 mm(日本YMC公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(瑞典Pharmacia Biotech公司)；RP18反相柱色谱硅胶(日本YMC公司)；柱色谱硅胶(200～300 目)及硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工有限公司)；色谱纯甲醇、乙腈(美国Tedia和Fisher公司)；96孔细胞培养板(NEST公司)；α-葡萄糖苷酶(克拉玛尔，批号：ZY210818)；阿卡波糖(MedChemExpress，批号：HY-B0089)；水为超纯水；所用其他分析纯试剂均为西陇化工股份有限公司产品。

1.2 植物材料

植物材料于2019年5月采集于广西壮族自治区武鸣县大明山，由广西师范大学生命科学学院唐绍清教授鉴定为杜鹃属植物小花杜鹃(Rhododendronminutiflorum)，植物样品标本(No.TS-20190505)保存于广西师范大学化学与药学学院省部共建“药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室”。

1.3 实验方法

1.3.1 提取与分离

小花杜鹃干燥茎叶13.4 kg，经95%乙醇-水加热回流提取3次，每次3 h，所得提取液经减压浓缩得到浸膏1.5 kg，浸膏加入适量蒸馏水悬浮后用乙酸乙酯萃取3次，萃取液经减压浓缩得到乙酸乙酯部位900 g。乙酸乙酯部位采用大孔树脂柱层析脱除色素并进行极性分段，以乙醇-水(3∶7→5∶5→8∶2→10∶0，V/V)和丙酮作为流动相依次洗脱，分离得到5个馏分(Fr.A～Fr.E)。馏分Fr.C(100.0 g)经硅胶柱色谱，二氯甲烷/甲醇(100∶1→1∶1，V/V)梯度洗脱得到12个亚馏分(Fr.C-1～Fr.C-12)。馏分Fr.C-1(367.8 mg)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱，甲醇等度洗脱得到7个亚馏分(Fr.C-1-1～Fr.C-1-7)，馏分Fr.C-1-7(25.0 mg)经制备型HPLC等度洗脱(37%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物7(tR=88.8 min，8.0 mg)。馏分Fr.C-4(516.0 mg)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱，甲醇等度洗脱得到6个亚馏分(Fr.C-4-1～Fr.C-4-6)，馏分Fr.C-4-4(42.0 mg)经制备型HPLC等度洗脱(37%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物5(tR=29.4 min，8.0 mg)和化合物6(tR=51.2 min，11.0 mg)。馏分Fr.C-5(2.1 g)经ODS柱色谱，甲醇-水(5∶5→10∶0，V/V)梯度洗脱得到7个亚馏分(Fr.C-5-1～Fr.C-5-7)。馏分Fr.C-5-3(164.5 mg)经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱，甲醇等度洗脱得到5个亚馏分(Fr.C-5-3-1～Fr.C-5-3-5)。馏分Fr.C-5-3-2(58.7 mg)经制备型HPLC等度洗脱(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物3(tR=83.2 min，28.2 mg)；馏分Fr.C-5-3-3(15.5 mg)经制备型HPLC等度洗脱(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物4(tR=117.0 min，4.7 mg)；馏分Fr.C-5-3-4(11.6 mg)经制备型HPLC等度洗脱(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物2(tR=93.5 min，3.0 mg)。馏分Fr.C-7(883.8 mg)经ODS柱色谱，甲醇-水(6∶4→10∶0，V/V)梯度洗脱得到5个亚馏分(Fr.C-7-1～Fr.C-7-5)，馏分Fr.C-7-2(17.4 mg)经制备型HPLC等度洗脱(30%乙腈水，流速8.0 mL/min)得到化合物8(tR=58.0 min，2.0 mg)和化合物9(tR=65.6 min，2.5 mg)。馏分Fr.E(60.0 g)经硅胶柱色谱，二氯甲烷/甲醇(100∶1→1∶1，V/V)梯度洗脱得到9个亚馏分(Fr.E-1～Fr.E-9)。馏分Fr.E-1(16.1 g)采用ODS柱色谱分离，甲醇-水(5:5→10:0，V/V)梯度洗脱得到6个亚馏分(Fr.E-1-1～Fr.E-1-6)。馏分Fr.E-1-2(7.4 mg)经制备型HPLC等度洗脱(55%甲醇水，流速6.0 mL/min)得到化合物1(tR=99.8 min，3.6 mg)。

1.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性测试

参照文献方法[11]并略作改进，具体方法如下：以PNPG为底物，阿卡波糖为阳性对照，实验分为空白组(不加α-葡萄糖苷酶液和样品化合物)、对照组(不加样品化合物)、样品化合物测定组、样品化合物空白组(不加α-葡萄糖苷酶液)，每组设置3个复孔。在96微孔板中加入适量(根据反应终止时体积为200 μL计算)磷酸盐缓冲液(pH =6.8)，0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶液50 μL和样品溶液50 μL(反应体系中样品终浓度为250.00、83.33、27.78、9.26、3.09 μM；阿卡波糖的终浓度分别为0.5×10-3、1.6×10-4、5.5×10-5、1.8×10-5、6.1×10-6、2.1×10-6、6.8×10-7、2.2×10-7mg/mL，50 μL)低速振荡摇匀，37 ℃孵育10 min，加入50 μL的PNPG(0.5 mmol/L)，低速振荡摇匀，37 ℃孵育30 min，再加入0.1 mol/L的碳酸钠溶液50 μL终止反应，于405 nm处测定吸光值。按下式计算目标化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。每组实验均重复三次，取平均值。并根据拟合的底物—抑制率方程计算IC50，结果用平均值±标准误表示。

其中，Ac为对照组，Ab为空白组，As为样品组，Asb为样品空白组。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

表1 化合物1的1H和13C NMR数据(400和150 MHz，CDCl3)Table 1 1H and 13C NMR data of compound 1(400 and 150 MHz,CDCl3)

经过文献检索发现，化合物1的主要一维谱信号与已被报道的苯骈呋喃型降木脂素fructusol A[12]的数据极为相似，结合分子式信息推测，两个化合物的主要区别在于化合物母核结构上C-9和C-3′位所连取代基的不同。经碳谱数据比较，结果显示化合物1比fructusol A多出2个羰基和2个甲基碳信号，且在HMBC谱中甲基质子信号δH2.09(3H，s，3′-OCOCH3)和连氧的亚甲基质子信号δH5.22(2H，d，J=0.8 Hz，H-3′)与碳信号δC171.1(3′-OCOCH3)均有相关；甲基质子信号δH2.11(3H，s，9-OCOCH3)和连氧的亚甲基质子信号δH4.75(2H，dd，J=6.4，1.2 Hz，H-9)与碳信号δC171.1(9-OCOCH3)均有相关。因此，推测化合物1(结构见图1)是fructusol A的9，3′-乙酰氧基取代衍生物。根据HMBC和1H-1H COSY等二维图谱中的其他关键相关信号(见图2)确定化合物1的结构，命名为rhodominutinan A，是1个天然产物中比较罕见的苯骈呋喃型降木脂素。化合物1和2的详细结构鉴定数据原始图谱可从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。

图1 化合物1～9的化学结构式Fig.1 The chemical structures of compounds 1-9

图2 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相关Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表2 化合物2的1H和13C NMR数据(400和150 MHz，CD3OD)Table 2 1H and 13C NMR data of compound 2(400 and 150 MHz,CD3OD)

通过比较发现化合物2与已知化合物(+)-isolariciresinol 9′-ferulate[13]的NMR数据较为相似，区别在于化合物2的C-9′所连侧链的不同。通过1H-1H COSY、HMBC和NOESY谱中的相关信号确定了化合物2的平面结构(见图3)，尽管HMBC谱中化合物C-7′′的羰基碳与H-9′没有显示出相关性，但化合物C-9′的化学位移(δC65.1)相对于(+)-isolariciresinol[13](δC62.2)增加了2.9 ppm，这说明苯甲酰氧基是与C-9′而不是与C-9相连。有趣的一个现象是在对其同类型化合物(+)-isolariciresinol 9′-p-coumarate[14]的结构解析中H-9′与酯基碳的相关性同样未见报道。在1H NMR谱中H-7′的耦合常数J=10.0 Hz，且NOESY谱中H-7′与H-8、H-9与H-8′均显示出相关性，由此确定了化合物2的相对构型。在圆二色谱图中，于274 nm处观察到正的Cotton效应，于292 nm处观察到负的Cotton效应，通过与文献报道的(+)-(8R,7′S,8′R)-9-acetoxy-9′-benzoyloxy-isolariciresinol[15]相比较，由此确定化合物2的立体构型为(8R,7′S,8′R)，并将其命名为rhodominutinan B，是1个新的苯二氢化萘型木脂素。

图3 化合物2的主要 1H-1H COSY、HMBC和NOESY相关Fig.3 Key 1H-1H COSY,HMBC and NOESY correlations of compound 2

化合物5无色针状结晶(氯仿)，易溶于氯仿;HR-ESI-MS：m/z205.044 6 [M+Na]+(calcd for 205.047 1)，结合1H和13C数据，确定其分子式为C9H10O4。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ：6.15(1H，d，J=2.4 Hz，H-3)，6.19(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，2.43(3H，s，H-8)，3.89(3H，s，H-9)；13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ：105.7(C-1)，163.8(C-2)，101.7(C-3)，166.2(C-4)，112.4(C-5)，144.5(C-6)，173.4(C-7)，24.3(C-8)，52.1(C-9)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物5为苔色酸甲酯。

化合物6无色针状结晶(氯仿)，易溶于氯仿;HR-ESI-MS：m/z219.062 1 [M+Na]+(calcd for 219.062 8)，结合1H和13C数据，确定其分子式为C10H12O4。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ：6.14(1H，d，J=2.4 Hz，H-3)，6.18(1H，d，J=2.4Hz，H-5)，2.44(3H，s，H-7)，4.34(2H，q，J=7.2 Hz，H-9)，1.38(3H，t，J=7.2 Hz，H-10)；13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ：105.7(C-1)，166.3(C-2)，101.7(C-3)，163.7(C-4)，112.5(C-5)，144.6(C-6)，24.5(C-7)，173.0(C-8)，62.1(C-9)，14.6(C-10)。以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物6为苔黑酚羧酸乙酯。

化合物7无色针状结晶(氯仿)，易溶于氯仿;HR-ESI-MS：m/z219.062 8 [M+Na]+(calcd for 219.062 8)，结合1H和13C数据，确定其分子式为C10H12O4。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：11.90(1H，s，2-OH)，6.12(1H，s，H-5)，5.39(1H，br s，4-OH)，3.89(3H，s，-OCH3)，2.42(3H，s，6-CH3)，2.00(3H，s，3-CH3)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：172.6(C =O)，163.0(C-4)，158.3(C-2)，139.9(C-6)，110.5(C-5)，108.5(C-3)，105.0(C-1)，51.9(-OCH3)，24.2(6-CH3)，7.6(3-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物7为2，4-二羟基-3，6-二甲基苯甲酸甲酯。

化合物8淡黄色无定型状粉末(甲醇)，易溶于甲醇;HR-ESI-MS：m/z293.041 2 [M+Na]+(calcd for 293.042 0)，结合1H和13C数据，确定其分子式为C15H10O5。1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：7.86(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)，6.60(1H，s，H-3)，6.46(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：183.9(C-4)，166.3(C-2)，166.0(C-7)，163.2(C-9)，162.8(C-4′)，159.4(C-5)，129.5(C-2′)，129.5(C-6′)，123.2(C-1′)，117.0(C-3′)，117.0(C-5′)，105.3(C-10)，103.8(C-3)，100.1(C-6)，95.0(C-8)。以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物8为芹菜素。

化合物9黄色无定型状粉末(甲醇)，易溶于甲醇;HR-ESI-MS：m/z287.055 1 [M+H]+(calcd for 287.055 0)，结合1H和13C数据，确定其分子式为C15H10O6。1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ：8.09(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.90(2H，d，J=8.4Hz，H-3′，H-5′)，6.40(1H，br s，H-8)，6.19(1H，br s，H-6)；13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ：177.4(C-4)，165.6(C-7)，162.5(C-5)，160.6(C-4′)，158.3(C-9)，148.1(C-2)，137.2(C-3)，130.7(C-2′/6′)，123.7(C-1′)，116.3(C-3′/5′)，104.5(C-10)，99.3(C-6)，94.4(C-8)。以上数据与文献报道基本一致[22]，故鉴定化合物9为山奈酚。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测试

本实验采用PNPG法对从小花杜鹃中分离得到的部分单体化合物进行体外α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选。结果表明化合物8和9具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且具有一定的剂量依赖性，其IC50值分别为57.51±6.35、54.70±3.67 μM(阳性对照药阿卡波糖的IC50值为3.07 nM)。化合物2由于分离得到的量少未对其进行活性测试，化合物1和3～7对α-葡萄糖苷酶均未表现出明显抑制活性。

3 结论

本实验对小花杜鹃95%乙醇提取物的化学成分及其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，从中分离鉴定了9个化合物，化合物的主要类型包括木脂素、黄酮以及酚类化合物。其中，化合物1是一个天然产物中比较罕见的苯骈呋喃型降木脂素，化合物2是一个新的苯二氢化萘型木脂素，其余化合物均为首次从小花杜鹃中分离得到。采用PNPG法对除化合物2外的其余8个化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，结果表明化合物8和9具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，实验所得结论与其他研究文献[23,24]报道相接近，由此推测芹菜素和山奈酚是小花杜鹃发挥体外降糖活性的重要物质基础之一。本实验首次开展了小花杜鹃化学成分和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，为小花杜鹃的植物化学资源合理开发利用提供参考依据。