E-cadherin在牦牛不同繁殖周期输卵管不同部位中的表达与定位

杨珊珊 何翃闳 刘敏清 赵 凌 王靖雷 余四九 蔡得琪 潘阳阳,*

(1甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070； 2甘肃省金昌市金川区农业农村局， 甘肃 金昌 737100)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒低氧地区的珍稀高原物种，与藏民的生产生活密切相关[1-2]。它以极强的生命力和适应性丰富着青藏高原地区的物质和文化生活[3-4]。但牦牛是一种季节性繁殖动物，其繁殖能力低下，因此了解雌性牦牛生殖器官的分子生物学特性，可进一步提高牦牛的繁殖率。在哺乳动物中，输卵管可发挥卵子摄取、精子储存和获能、受精以及受精卵发育和运输等一系列有规律的生物学功能，从而保证妊娠正常进行[5-6]。输卵管可根据其形态特征分为伞部、壶腹部和峡部，其中每一部分都参与特定的生理活动。输卵管伞部的主要功能是拾卵，壶腹部和峡部则有利于卵子、精子在输卵管中顺利转运及融合。卵子通过纤毛细胞的摆动和管壁的收缩运行至壶腹部，最终与获能的精子相遇并发生结合[7-8]。因此，输卵管整体为受精和胚胎早期的正常发育提供了良好的环境[9]。在哺乳动物输卵管中精子和卵子的运送与结合依赖于母体分泌的蛋白和调节因子，因此鉴定与精卵相互作用有关的蛋白质可帮助了解受精的分子基础，从而有助于提高牦牛的繁殖性能[10]。

上皮钙粘蛋白(E-cadherin)为Ca2+依赖性单链跨膜糖蛋白，包含5个由110个氨基酸组成的胞外结构域、一个跨膜结构域和一个高度保守的细胞质结构域，该结构域通过适配器蛋白(如β-连环蛋白)与肌动蛋白细胞骨架相互作用，可介导钙依赖性细胞间粘附[11]。E-cadherin主要分布在上皮细胞表面，介导同种或异种细胞间的粘附，参与形成和维护正常细胞间的连接，其在胚胎发育、细胞生长、细胞分化以及成体组织结构的维持中起着关键作用[12-13]。早期有研究发现E-cadherin在人[14-15]和奶牛[16]的卵母细胞、精子、输卵管上皮和子宫上皮中均有表达。另外，E-cadherin在大鼠配子中也有表达[17]。对与输卵管上皮细胞共培养的精子中E-cadherin进行重新定位后发现，E-cadherin在输卵管-精子库的组装或拆卸中发挥作用[18]。通过敲除E-cadherin的小鼠模型发现，缺失E-cadherin的突变胚胎不能形成滋养层上皮[19]。Ideta等[20]研究发现，E-cadherin可参与配子的交互作用，也可促进上皮细胞之间的选择性粘附，并参与早期胚胎与子宫内膜上皮的初步粘附。同时，针对功能的研究指出E-cadherin参与精卵的相互作用及精卵与女性生殖上皮细胞之间的粘附，从而促进输卵管受精[21-22]。此外，有研究证实E-cadherin可能与其他蛋白质结合，在发情周期调节配子或囊胚与输卵管或子宫上皮之间的相互作用，提高细胞间粘附力，从而有助于配子在输卵管中正常发育[23]。

综上所述，E-cadherin对精卵的相互作用及早期的胚胎发育具有重要作用。然而，该蛋白在牦牛不同繁殖周期输卵管不同部位的表达研究在国内外尚鲜见报道。因此，本试验以牦牛输卵管为研究对象，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)、蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法对E-cadherin基因及蛋白在牦牛不同繁殖周期输卵管中不同部位的表达和定位进行研究，为E-cadherin在牦牛不同繁殖周期输卵管中的作用研究提供先决条件，从而为进一步探讨E-cadherin在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取无临床病理表现的卵泡期、黄体期和妊娠期母牦牛(3～6岁)各6头(样品采于青海省西宁市百德屠宰场)，颈动脉放血处死，并分别采取卵泡期后期(有优势卵泡>6 mm)、黄体期后期(可见多个黄体)同侧以及妊娠期早期(胚胎约长2～3 cm)妊娠侧[24]的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品，并用0.9%生理盐水冲洗数次，一部分用锡箔纸包裹作为组织样品放进有标记的布袋中，置于液氮中4 h内运回实验室，-80℃超低温冰箱中保存备用；另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，4℃保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

E-cadherin(4A2)mouse mAb(#14472)抗体购自美国Cell SignalinGTechnology公司；二抗(Goat Anti-Mouse IgG/HRP)、Mo a beta-Actin(bsm-33 036M)购自北京博奥森生物技术有限公司；TransZol试剂盒购自北京全式金公司；两步法反转录试剂盒(Go ScriptTMReverse Transcription System)购自美国Promega公司；蛋白裂解液购自北京索莱宝公司；GoTaq®Green Master Mix 2×购自美国Promega公司；BeyoEcl曝光液购自中国Beyotime公司；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自日本宝生物公司；阳离子防脱片购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组化染色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；T100TMThermal Cycler PCR仪购自美国BioRad公司；LighTCycler 96实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；DP71显微照相装置购自日本Olympus公司。

1.3 E-cadherin基因的表达检测

参照GeneBank数据库中检索牛E-cadherin基因(NM_001002763.1)和牦牛β-actin基因(DQ838049.1)的mRNA序列，利用Primer Premier 6.0软件设计E-cadherin和β-actin的引物(引物信息见表1)(E-cadherin引物浓度为10 μmol·L-1；β-actin引物浓度为10 μmol·L-1)，引物序列均在上海生工基因科技有限公司合成。将保存于-80℃的卵泡期、黄体期和妊娠期的牦牛输卵管不同部位的组织研成粉末状并称量0.1 g后装入标记好的无RNA酶的EP管中，用TransZol试剂盒法提取总RNA，用分光光度计测定RNA浓度。按照反转录试剂盒步骤于PCR仪中将RNA反转录为cDNA并保存于-20℃备用。将卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组，每组3个复孔，分别为待测孔、内参对照孔和空白对照孔，以cDNA为模板，E-cadherin基因和β-actin基因为引物进行qRT-PCR的扩增。反应总体系为20 μL：cDNA 1 μL、上下游引物各0.8 μL、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、无菌去离子水7.4 μL。反应条件：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸20 s，40个循环。每个样品重复4次，根据每个样品的循环定量值(Cq)，经2-ΔΔCt法计算E-cadherin基因在牦牛不同繁殖时期输卵管不同部位中的相对表达量。

表1 目的基因和内参基因引物序列Table 1 Primer sequences of targeTGene and housekeepinGGene

1.4 E-cadherin蛋白表达检测

将-80℃保存的卵泡期、黄体期和妊娠期牦牛输卵管伞部、壶腹部和峡部的组织样品低温研磨成粉末，并称取0.1 g并加入裂解液[1 mL高效RIPA组织/细胞裂解液(radio immunoprecipitation assay, RIPA)]+[10 μL苯甲基磺酰氟(phenylm methane sulfonyl fluoride, PMSF)]，涡旋后在冰上裂解2 h、4℃，1 500 r·min-1离心5 min后吸取上清，提取总蛋白于-80℃保存。将卵泡期、黄体期和妊娠期牦牛输卵管伞部、壶腹部和峡部的蛋白样品与4×蛋白上样缓冲液按照3∶1的比例配置蛋白工作液，金属浴变性(100℃，10 min)，冰上静置5 min。制备好聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)并进行电泳分离；将依次按照滤纸、胶、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、滤纸从下到上的顺序将其固定于转膜夹上，并将蛋白转至PVDF膜；用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h；一抗[E-cadherin(4A2)mouse mAb∶PBST=1∶1 000；Mo a beta-Actin∶PBST=1∶1 000]孵育在4℃环境中过夜，PBST清洗3次，每次5 min；二抗(Goat Anti-Mouse IgG/HRP∶PBST=1∶1 000)孵育2 h，PBST清洗5次，每次5 min；在膜上滴加电化学发光液(electro-chemi-luminescence, ECL)进行条带曝光显影，试验重复3次，并用ImageJ软件扫描蛋白印迹条带进行图像分析，计算相对表达量。

1.5 免疫组织化学法对E-cadherin蛋白进行定位

取多聚甲醛中充分固定好的不同繁殖周期输卵管伞部、壶腹部和峡部组织块样品，根据常规方法制作4 μm石蜡切片贴附于包被过的切片上，下行酒精脱蜡至水，蒸馏水清洗5 min，PBS浸泡5 min。将切片置于0.1 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液中抗原修复，高温加热8 min至沸腾后转中高温加热12 min，待其冷却至室温。滴加内源性过氧化物酶阻断剂(3% H2O2溶液)于组织上进行阻断，37℃烘箱中孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。滴加正常山羊血清工作液(SP试剂盒A液)于组织上进行封闭，室温作用15 min。添加一抗[E-cadherin(4A2)mouse mAb∶PBS=1∶100]孵育，阴性对照组用PBS代替一抗工作液，在4℃环境中过夜，阳性反应与阴性对照组分开清洗，PBS清洗3次，每次3 min。添加生物素标记山羊抗小鼠IgG(SP试剂盒B液)孵育，37℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。添加辣根酶标记链霉卵白素工作液(SP试剂盒C液)孵育，37℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。DAB显色液适度显色，自来水冲洗10 min终止显色，蒸馏水浸泡5 min。苏木精复染2 min并通过盐酸酒精分化10 s。上行酒精脱水透明，树脂封片，待晾干用显微镜照相。

1.6 数据分析

利用SPSS 21.0软件对试验所得数据进行单因素方差分析，分析不同繁殖周期输卵管不同部位中E-cadherin基因及蛋白的表达差异，相对表达水平为平均值±标准差(Mean±SE)表示，每组至少3个重复。P>0.05为差异不显著，0.01≤P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 E-cadherin基因的表达情况

普通PCR试验结果表明，E-cadherin基因和β-actin基因产物条带单一并无二聚体，验证了引物E-cadherin基因和β-actin基因的特异性良好(图1)。通过对qRT-PCR的Cq值进行分析发现，在卵泡期和妊娠期，E-cadherin基因在输卵管壶腹部的表达量最高，显著高于伞部；而在黄体期，E-cadherin基因在输卵管峡部的表达量最高，显著高于伞部和壶腹部。在输卵管伞部，E-cadherin基因在黄体期的表达量最高，显著高于卵泡期和妊娠期；在输卵管壶腹部，E-cadherin基因在妊娠期的表达量最高，显著高于卵泡期和黄体期；在输卵管峡部，E-cadherin基因在黄体期的表达量最高，显著高于卵泡期和妊娠期(图2)。

注：M：DNA相对分子质量标准；1：卵泡期输卵管伞部；2：卵泡期输卵管壶腹部；3：卵泡期输卵管峡部；4：黄体期输卵管伞部； 5：黄体期输卵管壶腹部；6：黄体期输卵管峡部；7：妊娠期输卵管伞部；8：妊娠期输卵管壶腹部；9：妊娠期输卵管峡部。Note: M: D2000 DNA marker. 1: Oviduct umbrella durinGThe follicular phase. 2: Oviduct ampulla durinGThe follicular phase. 3: Oviduct isthmus durinGThe follicular phase. 4: Oviduct umbrella durinGThe luteal phase. 5: Oviduct ampulla durinGThe luteal phase. 6: Oviduct isthmus durinGThe luteal phase. 7: Oviduct umbrella durinGThe pregnant phase. 8: Oviduct ampulla durinGThe pregnant phase. 9: Oviduct isthmus durinGThe pregnant phase.图1 E-cadherin和β-actin基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results for E-cadherin and β-actin genes

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.图2 牦牛E-cadherin基因在不同繁殖周期输卵管不同部位中的表达差异Fig.2 Differential expression of E-cadherin gene in different parts of the oviduct at different reproduction cycles of yak

2.2 E-cadherin蛋白的表达情况

Western-blotting试验分析结果显示，E-cadherin蛋白在不同时期输卵管的不同部位均有表达且存在差异(图3)。在卵泡期和妊娠期，E-cadherin蛋白在输卵管壶腹部的表达量最高，显著高于伞部和峡部；在黄体期，E-cadherin蛋白在输卵管峡部的表达量最高，显著高于伞部和壶腹部。在输卵管伞部，E-cadherin 蛋白在卵泡期的表达量最高，显著高于黄体期和妊娠期；在输卵管壶腹部，E-cadherin蛋白在妊娠期的表达量最高，显著高于卵泡期和黄体期；在输卵管峡部，E-cadherin蛋白在黄体期的表达量最高，显著高于卵泡期和妊娠期(图4)。

注：1：卵泡期输卵管伞部；2：卵泡期输卵管壶腹部；3：卵泡期输卵管峡部；4：黄体期输卵管伞部；5：黄体期输卵管壶腹部；6：黄体期输卵管峡部；7：妊娠期输卵管伞部；8：妊娠期输卵管壶腹 部；9：妊娠期输卵管峡部。Note: 1: Oviduct umbrella durinGThe follicular phase. 2: Oviduct ampulla durinGThe follicular phase. 3: Oviduct isthmus durinGThe follicular phase. 4: Oviduct umbrella durinGThe luteal phase. 5: Oviduct ampulla durinGThe luteal phase. 6: Oviduct isthmus durinGThe luteal phase. 7: Oviduct umbrella durinGThe pregnant phase. 8: Oviduct ampulla durinGThe pregnant phase. 9: Oviduct isthmus durinGThe pregnant phase.图3 E-cadherin和β-actin蛋白的免疫蛋白印迹条带Fig.3 The Western-blotting bands of E-cadherin and β-actin proteins

2.3 E-cadherin蛋白的定位

免疫组织化学试验结果发现，E-cadherin在输卵管中均有分布，在卵泡期、黄体期和妊娠期，E-cadherin主要在输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中有表达(图5-a～i)；阴性对照试验未见棕褐色阳性表达(图5-j～l)。

3 讨论

图4 牦牛E-cadherin蛋白在不同繁殖周期输卵管不同部位中的表达差异Fig.4 Differential expression of E-cadherin protein in different parts of the oviduct at different reproduction cycles of yak

注：a：卵泡期输卵管伞部；b：卵泡期输卵管壶腹部；c：卵泡期输卵管峡部；d：黄体期输卵管伞部；e：黄体期输卵管壶腹部；f：黄体期输卵管峡部；g：妊娠期输卵管伞部；h：妊娠期输卵管壶腹部；i：妊娠期输卵管峡部；j：输卵管伞部阴性对照；k：输卵管壶腹部阴性对照；l：输卵管峡部阴性对照。LP：固有层；TM：肌层；EP：黏膜上皮；P：初级皱襞；S：次级皱襞；C：纤毛细胞。黑色五角星：分泌细胞；黑色 细箭头：基细胞；黑色三角形：浆液腺。Note: a: Tubal umbrella durinGThe follicular phase. b: Tubal ampulla durinGThe follicular phase. c: Tubal isthmus durinGThe follicular phase. d: Tubal umbrella durinGThe luteal phase. e: Tubal ampulla durinGThe luteal phase. f: Tubal isthmus durinGThe luteal phase. g: Tubal umbrella durinGThe pregnant phase. h: Tubal ampulla durinGThe pregnant phase. i: Tubal isthmus durinGThe pregnant phase. j: Tubal umbrella negative control. k: Tubal ampulla negative control. l: Tubal isthmus negative control. LP: Lamina propria. TM: Muscular layer. EP: Mucosal epithelium. P: Primary wrinkles. S: Secondary wrinkles. C: Ciliated cell. Black five-pointed star: Secretory cell. Black thin arrow: Basal cell. Black triangle: Serous gland.图5 牦牛E-cadherin蛋白在不同繁殖周期输卵管不同部位中的免疫组织化学染色Fig.5 Immunohistochemical staining of E-cadherin protein in different parts of the oviduct at different reproductive cycles of yak

在细胞粘附分子超家族成员中，E-cadherin是钙依赖性细胞间粘附相关的跨膜糖蛋白，在维持上皮结构、细胞生长增殖和细胞间粘附等方面起着重要作用[25-26]。有研究表明，在人的精子、卵母细胞、卵丘细胞以及输卵管上皮细胞中检测到E-cadherin[27]。本研究发现其主要在牦牛输卵管的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中表达。研究结果显示，E-cadherin主要参与多种钙依赖嗜同性细胞之间粘附事件，衔接蛋白β-catenin可与E-cadherin胞质结构域结合，将粘附蛋白连接到细胞骨架上[28]，从而发挥信号传递和细胞稳定的作用。本研究在牦牛输卵管的相应部位发现了E-cadherin的表达，这与在人体中的报道相一致[27]，由此可推测，E-cadherin在牦牛输卵管中也发挥着重要的作用。

为了进一步探究E-cadherin在牦牛输卵管中的表达情况，本试验分别在卵泡期、黄体期和妊娠期检测了E-cadherin基因及蛋白在输卵管伞部、壶腹部及峡部的表达情况。结果显示，在卵泡期，E-cadherin基因及蛋白在输卵管壶腹部的表达量最高，峡部表达量最低。在输卵管伞部，E-cadherin蛋白在卵泡期的表达量最高，在妊娠期的表达量最低。然而，E-cadherin基因在黄体期的表达量最高，妊娠期的表达量最低。有研究报道，基因的转录和蛋白的翻译存在时空差异[29]，这可能是造成E-cadherin基因及蛋白存在表达差异的主要原因。有报道称E-cadherin主要参与同型细胞与细胞间粘附进而完成细胞间的相互作用[30]。同时，在繁殖周期母体中，E-cadherin也会协同某些激素和细胞因子，使输卵管微环境发生变化[31]。因此，卵泡期E-cadherin在输卵管伞部表达高可能是因为卵母细胞被输卵管伞部细胞的表面受体粘附并接收，从而通过伞部粘膜的摆动将卵子运输至输卵管中，在相关细胞因子的作用下，卵母细胞在输卵管中成熟并与获能精子相遇并融合。

黄体作为卵泡破裂后形成的临时器官，可分泌大量孕酮以维持雌性动物正常的生殖机能。本研究发现在黄体期，E-cadherin基因及蛋白在输卵管峡部的表达量最高，壶腹部表达量最低。同时对于输卵管峡部来说，E-cadherin基因及蛋白在黄体期表达量最高，卵泡期表达量最低。精子在尾端峡部和子宫输卵管连接部储存且获能启动，并被准确释放到受精部位[32]，E-cadherin作为复杂膜蛋白的一部分，在精子获能事件中发挥着重要作用。在精子通过女性生殖道的过程中，E-cadherin可确保精子与输卵管上皮进行结合和释放[33]。同时，E-cadherin还能够诱导与输卵管上皮细胞结合的精子中某些蛋白激酶的酪氨酸磷酸化及细胞内钙离子水平的增加，使其能够被释放并继续转运到壶腹部与卵子结合。这证明了E-cadherin在精卵相互作用过程参与粘附事件[34-35]。另外，有研究采用DECMA-1抗E-cadherin单克隆抗体后发现，精子与卵母细胞的相互作用明显受损[36]。综上可以推测E-cadherin参与了输卵管峡部发挥精子储存库的功能，从而有助于精卵结合，但其输卵管峡部精子“储存器”的形成及精子释放并与卵子结合的具体机制仍有待深入研究。

精卵在输卵管壶腹部结合后被运送至子宫着床，动物进入妊娠期。在妊娠期，E-cadherin在输卵管壶腹部的表达量最高，在输卵管伞部的表达量最少。同时对于输卵管壶腹部而言，E-cadherin基因及蛋白在妊娠期的表达量相对较高，在黄体期的表达量最少。在附植前的人胚胎表面可检测到E-cadherin的表达，胚胎表面的E-cadherin能与子宫内膜细胞表面的同类分子互为配体，形成细胞间分子连接，使胚胎能够粘附于内膜，为进一步植入提供前提条件[20]。子宫内膜“植入窗”的形成，除了受卵巢激素控制外，胚胎在其中也有着主要作用，二者发育相互影响、相互调节以达到同步，同时具有容受性和粘附性，胚胎着床才能够进行。胚胎上的E-cadherin可能影响内膜上皮E-cadherin的表达，相互调节以达到理想的植入窗状态,最终目的是利于胚胎着床[37-38]。另外有数据也显示在犬中，输卵管细胞可支持胚胎通过关键的细胞分裂M期[39]。与单独培养相比，犬胚胎与输卵管组织或输卵管细胞共培养可增强其早期发育。因此，本研究发现E-cadherin在输卵管壶腹部表达量高，推测其参与妊娠早期的胚胎发育与运输过程，以待更好地完成整个繁殖周期的发展过程。

本研究发现，E-cadherin基因和蛋白在牦牛不同繁殖周期输卵管不同部位中的表达存在显著差异，推测E-cadherin在牦牛接收卵子、储存精子、受精及早期胚胎发育方面可能发挥着重要作用。本研究为牦牛的繁殖性能研究提供理论依据。

4 结论

在牦牛不同繁殖周期中E-cadherin在输卵管伞部、壶腹部和峡部中均有表达且存在表达差异，其主要在不同繁殖周期输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺等中有分布。由此推测E-cadherin可能参与了输卵管受精及早期胚胎发育等生殖过程。