虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾取食及解毒酶的影响

余源婵 杨茂发,,* 商胜华 刘健锋 于晓飞 狄雪塬

(1 贵州山地农业病虫害重点实验室/贵州大学昆虫研究所，贵州 贵阳 550025；2 贵州大学烟草学院， 贵州 贵阳 550025；3 贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081)

植物在与昆虫长期协同进化的过程中形成了多种可遗传抵制昆虫侵害的防御机制及策略[1]。植物对植食性昆虫的防御机制体系可分为组成型防御和诱导型防御[2]，两者均存在物理和化学上的防御作用。其中组成型防御主要指植物利用本身固有且不依赖于外界胁迫存在的外部结构和内部原有组成化合物来阻碍昆虫附着取食，如植物角质层上的光滑蜡质、表皮上的刺和毛状体等[3-4]。植物体内的自然组分如芥子油苷、烟碱等对为害昆虫具有致死作用[5-6]。诱导型防御即植物受到虫害等外界胁迫时诱导作物启动一系列化学防御和物理防御，如次生代谢物、防御蛋白以及部分营养成分的改变等，可对昆虫的取食产生忌避或抑制，进而杀死害虫或延缓害虫的生长发育，扰乱昆虫的正常生理代谢[7]；经诱导改变叶脉结构、叶片厚度、叶面茸毛和刺，增加木质化程度等来提高植物的虫食耐受性[7-8]。此外，虫害诱导的植物挥发物还可吸引寄生和捕食性天敌控制害虫，或趋避植食性昆虫成虫产卵等[9]。相关研究表明，植物为抵御植食性昆虫侵害所进化出的虫害诱导抗性可明显提高植物的适生性[10-11]，且这种植物诱导抗性具有一定遗传性[12]。

烟草(NicotianatabacumL.)是我国重要的农业经济作物，在我国国民经济中占有重要地位[13]。为满足实际生产需求，多种人为培育的产量高、品质优良的烟草品种的部分抗性机制与野生型烟草相比被极大削弱[14-15]，导致实际生产中大部分烟草的农田生态系统较为脆弱，极易感染病虫草害。斜纹夜蛾(SpodopteralituraFabricius)，隶属鳞翅目夜蛾科，取食的寄主达300多种，可直接导致作物严重减产26%～100%[16]，同时也是烟草栽培的主要害虫之一，其幼虫啃食烟株的烟叶、花蕾和果实等，严重影响到烟叶的生产和烟草育种工作的开展[17]。目前大田中仍以化学农药灭杀为主、其他防治为辅的方式来防治斜纹夜蛾，但化学防控严重污染环境且会增加烟草的农残量。通过探究虫害诱导植物抗性对后取食昆虫的影响，有助于寻找合适方法使植物产生抗虫防御警备，从而减少杀虫剂的使用[18]。本研究以雄性不育品系K326烟草品种为材料，研究在烟蚜[Myzuspersicae(Sulzer)]、斜纹夜蛾和棉铃虫[Helicoverpaarmigera(Hübner)]等虫害胁迫下，烟草诱导抗性对斜纹夜蛾取食和解毒酶系的影响，以机械损伤诱导和未作任何处理的烟草为阳性和阴性对照，探究不同虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾的抵御水平，以期为培育优化烟草抗性品种和斜纹夜蛾的田间综合防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年9—11月在贵州大学昆虫研究所的实验温棚及人工气候室内完成。供试烟草为雄性不育K326(male sterility K326，MS K326)，由遵义市进化镇烟草天敌繁育中心提供。在温室大棚中进行漂浮育苗，正常管理，待烟苗长至4片真叶时，用营养腐殖土进行单株培育，将盆栽烟苗移入无虫纱网笼中长至6片真叶时供试。

供试昆虫烟蚜采自贵州省遵义市凤冈县进化镇烟田，随后在自然环境下的MS K326烟株上继代笼罩饲养，挑取无翅成蚜饥饿3 h后供试。斜纹夜蛾种群为贵州大学昆虫研究所实验室(L∶D=14∶10；温度27±1℃；湿度70%±5%)长期建立的稳定饲料种群，饲料配方参照文献[19]。将近孵化的斜纹夜蛾卵块放在幼嫩烟苗上，用防虫网笼隔离饲养至3龄幼虫时，选取大小一致的3龄幼虫饥饿12 h后供试。棉铃虫购于河南省济源白云实业有限公司，饲养及试验处理条件同斜纹夜蛾。

1.2 试验设计

选取长势相同的烟株，抗性诱导处理位置为烟株上部从上至下数第一片完全展开叶(除心叶外)。共设6种处理：CK，未作任何处理的烟株；斜纹夜蛾诱导处理，参考Zong等[20]的方法并略作修改，将1头饥饿处理12 h的斜纹夜蛾3龄幼虫投放到指定诱导叶片并套上透明纱网袋，当其取食时开始正常计时，24 h后移除虫体及套袋；棉铃虫诱导处理，与斜纹夜蛾取食诱导处理相似；机械(打孔)处理，利用自制打孔器(d=0.5 cm)对指定诱导叶片进行轮流打孔处理，分别在0、6、12、18 h各进行一轮打孔；烟蚜诱导处理，用湿润小毛笔挑取15头无翅成蚜至烟草指定诱导叶背面并套袋，待烟蚜稳定取食10 min后开始计时，24 h后用软毛笔轻轻刷去烟蚜；机械(针刺)处理，利用显微注射针5根一束，分别在5、10 min时对指定诱导叶片进行针刺，针刺3次为一组，之后开始正式处理计时。全部植株处理24 h后备用。每处理重复3次以上。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 斜纹夜蛾幼虫取食选择试验 参照王洪涛等[21]方法，略作修改。将采集的6种处理植株叶片(烟株上部第二片完全展开叶)制作成直径为2 cm的叶碟，放置在底部有浸湿滤纸的培养皿(直径14 cm)中，每皿接入10头初孵幼虫(孵化12 h内)或饥饿处理后的1头3龄幼虫，2种处理分别重复20和40次。移入人工气候箱(L∶D=14∶10；温度27±1℃；湿度70%±5%)中，取食24 h后检查培养皿内不同处理叶碟片上取食的幼虫数，计算初孵幼虫取食选择率。

利用激光多功能打印一体机对3龄虫体取食后的剩余叶碟片面积进行扫描，之后用特定的处理软件Image J计算剩余叶片面积，从而计算虫体取食面积。

1.3.2 斜纹夜蛾幼虫解毒酶活性测定 3龄斜纹夜蛾幼虫饥饿处理12 h后，分别转移至各处理烟叶上饲养，每个饲养盒转接5头斜纹夜蛾幼虫作为1个重复，每种烟叶处理共设8个重复，即每个处理共有40头幼虫，分8个饲养盒饲喂。分别在饲养4、12、24、48 h时取各处理时段后的斜纹夜蛾试虫液氮速冻后冻存至-80℃冰箱，用于后续酶活性测定。将冻存虫体样品取出加液氮研磨后分别称取0.1 g加入1 mL各测定指标提取液，快速震荡摇匀后按照对应的说明书要求进行低温离心，取上清液置于冰上待测。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)、多功能氧化酶(mixed-functional oxidase，MFO)等酶活性和酶原蛋白含量测定分别按照试剂盒(苏州科铭生物科技有限公司)说明书进行。每个处理设生物学重复3次，技术重复3次。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2019进行数据整理统计，利用DPS V7.05对数据进行5%的差异显著性检验，所有数据均以平均值±标准误表示。采用GraphPad Prism 7.0绘图。

2 结果与分析

2.1 不同虫害诱导烟株烟叶对斜纹夜蛾取食的影响

如图1-A所示，各种虫害处理烟株中，斜纹夜蛾的初孵幼虫对斜纹夜蛾(DS)处理株烟叶的选择取食率与CK(14.45%)相比差异显著，仅有8.96%，初孵幼虫对棉铃虫(DH)和烟蚜(DM)处理株烟叶的取食选择率与CK接近，分别为11.00%和14.67%。此外，初孵幼虫对2种机械损伤(MP和MN)处理的烟株烟叶选择取食率均与CK无显著差异。可见，3种虫害烟株中，斜纹夜蛾的初孵幼虫偏爱取食烟蚜处理株烟叶，而相对拒食斜纹夜蛾处理株烟叶。由图1-B可知，3种虫害诱导抗性对斜纹夜蛾3龄幼虫的取食量无显著影响，与CK相比，斜纹夜蛾幼虫显著偏好取食机械打孔处理诱导的烟株。

注：CK：健康未接虫植株；MP：机械打孔；DH：棉铃虫取食；DS：斜纹夜蛾取食；DM：烟蚜取食； MN：机械针刺。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: CK: Healthy plant. MP: Mechanical pricks. DH: Damaged by H. armigera. DS: Damaged by S. litura. DM: Damaged by M. persicae. MN: Mechanical needles. Different lowercase letters show significant difference at 0.05 level. The same as following.图1 不同虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾初孵幼虫取食选择率(A)和3龄幼虫取食面积(B)的影响Fig.1 Effects of tobacco resistance induced by different pests on the feeding selection rate (A) of the newly hatched larvAAnd feedinGArea of 3rd instar larvae (B) of S. litura

2.2 不同虫害叶对斜纹夜蛾解毒酶活性的影响

2.2.1 对斜纹夜蛾AchE活性的影响 由表1可知，斜纹夜蛾3龄幼虫取食不同虫害诱导烟草抗性的烟叶后，体内AchE活性均被诱导升高，且各虫害诱导后的AchE活性变化趋势具有特异性，其中取食烟蚜虫害处理组烟叶的斜纹夜蛾幼虫AchE活性在48 h内被激活的幅度最大；取食棉铃虫虫害处理组烟叶的斜纹夜蛾幼虫体内AchE活性在24 h时较CK显著提高29.56%，取食斜纹夜蛾虫害组烟叶的幼虫活性在48 h时较CK显著提高21.35%，烟蚜虫害组烟叶处理的虫体酶活性则分别在12和48 h时较CK显著提高36.45%和65.17%；取食机械打孔和针刺处理组烟叶后斜纹夜蛾幼虫体内的AchE活性分别在12和24 h时较CK显著提高了37.38%和33.04%。

2.2.2 对斜纹夜蛾CarE活性的影响 由表2可知，斜纹夜蛾3龄幼虫取食各虫害诱导的烟叶后体内CarE活性变化不同。斜纹夜蛾取食各虫害诱导处理的烟叶后体内CarE活性在24 h内均呈逐渐上升趋势；48 h时，取食棉铃虫和斜纹夜蛾诱导处理烟叶的斜纹夜蛾虫体CarE活性持续升高，其中棉铃虫诱导处理组较CK显著提高了14.38%，斜纹夜蛾诱导处理组升高至与CK接近，烟蚜诱导处理组则呈下降趋势。取食机械打孔诱导烟叶的斜纹夜蛾CarE活性在48 h内较CK无明显升高，取食针刺诱导的烟叶后斜纹夜蛾的CarE活性则分别在4和24 h时较CK显著提高了22.61%和39.82%。

表1 不同虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾3龄幼虫AchE活性的影响Table 1 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on AchE activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

表2 不同虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾3龄幼虫CarE活性的影响Table 2 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on CarE activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

2.2.3 对斜纹夜蛾GST活性的影响 由表3可知，斜纹夜蛾3龄幼虫取食不同虫害诱导烟叶后体内GST活性变化有所差异，其中取食棉铃虫和斜纹夜蛾诱导处理的烟叶后活性在48 h内整体受到抑制或升高后与CK接近，取食烟蚜诱导处理组的GST活性则在4 h时较CK显著提高了47.47%，之后活性较CK显著降低。取食打孔处理烟叶的斜纹夜蛾幼虫GST活性在12 h时抑制明显；针刺处理组除24 h时GST活性与CK接近，其余时间段GST活性均被显著抑制。

2.2.4 对斜纹夜蛾3龄幼虫MFO活性的影响 由表4可知，斜纹夜蛾3龄幼虫取食各虫害诱导的烟叶后体内MFO活性变化存在差异。其中棉铃虫诱导处理组的MFO活性在48 h内变化不明显，24 h时活性仅为CK的70.00%，显著受到抑制；取食斜纹夜蛾诱导处理的烟叶后，斜纹夜蛾幼虫的MFO活性呈先降低后升高再趋于平稳的趋势，48 h时活性较CK显著提高了72.22%。取食机械打孔诱导处理烟叶后斜纹夜蛾幼虫MFO活性在48 h时升高至接近对照；针刺处理的MFO活性4 h时与对照接受后呈逐渐下降趋势。

表3 不同虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾3龄幼虫GST活性的影响Table 3 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on GST activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

表4 不同虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾3龄幼虫MFO活性的影响Table 4 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on MFO activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

3 讨论

虫害诱导的植物防御反应会改变后取食昆虫的食物质量[22-24]，影响昆虫的正常取食，破坏昆虫机体正常的生理代谢[25]。本研究发现，面对6种处理株烟叶，斜纹夜蛾初孵幼虫偏好取食烟蚜和打孔诱导株烟叶，而相对避免取食斜纹夜蛾诱导株烟叶；3龄幼虫则偏好大量取食打孔诱导株烟叶。Serteyn等[26]研究发现茶翅蝽(Halyomorphahalys)诱导的蚕豆(ViciafabaL.)植株会延迟后取食茶翅蝽的针刺,同时缩短持续取食时间；胡海燕[27]研究表明，B型烟粉虱[Bemisiatabaci(Gennadius)]诱导的烟草防御反应提高了后取食B型烟粉虱对温室白粉虱[Trialeurodesvaporariorum(Westwood)]的种间竞争优势。不同虫害诱导烟草防御生理存在显著差异[6]，推测后取食者对不同诱导烟草的取食选择不同，可能与寄主植物诱导的防御生理及挥发物成分差异有关[28-29]，其具体机制还有待进一步研究。

昆虫在长期进化中形成了解毒、避毒、藏毒等适应机制来应对植物体内各种防御蛋白胁迫[30]，如调整体内乙酰胆碱酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和多功能氧化酶(MFO)等解毒酶活性变化[31-32]，可对摄入体内的外源毒素和植物次生物质进行解毒和排毒。其中，AchE可快速水解神经递质乙酰胆碱从而终止神经冲动的传递增加虫体耐受性；CarE可与外源毒素结合催化水解抑制其活性减轻机体损伤；MFO可通过过氧烷基、羟基化环氧化和硫醚氢化等方式参与多种杀虫剂和自然毒素的代谢；GST可增加虫体对有毒物质的可溶性并将其排出体外[33-34]。前人研究表明，虫害诱导植物防御对后继的植食性昆虫既有诱导作用也有抑制作用，如胡海燕[27]研究发现B型烟粉虱取食其自身为害的烟草叶，其成虫体内CarE、GST活性均明显升高；而温室白粉虱成虫取食B型烟粉虱为害后的烟草叶后体内的CarE和GST活性均被显著抑制。牟峰等[35]研究表明西花蓟马[Frankliniellaoccidentalis(Pergande)]危害菜豆[PhaseolusvulgarisLinn.]后对西花蓟马解毒酶、保护酶和消化酶均起到抑制作用，削弱了虫体对有毒次生物质的解毒代谢功能。在本研究中，取食棉铃虫、斜纹夜蛾和烟蚜诱导处理烟草叶片的斜纹夜蛾体内AchE活性分别在24、48、12和48 h时活性显著升高，而各处理对应的另外3种酶(CarE、EMFO和GST)活性则在处理48 h内被不同程度地激活或抑制。取食针刺烟叶可激活斜纹夜蛾体内AchE和CarE活性，而取食打孔烟叶仅激活斜纹夜蛾体内AchE活性。表明不同诱导株烟叶均可激活斜纹夜蛾AchE活性，其他解毒酶活性响应存在明显的处理特异性。昆虫啃食植物除了造成明显的机械损伤外，还会使创面沾上口腔中分泌的唾液[36]；唾液分泌物中含有能引起并触发植物特异性防御反应的昆虫特异性激发子，昆虫口腔分泌物激发子种类繁多，所诱导的植物虫害诱导抗性也存在物种差异性[37-38]。因而推测以上结果可能与不同昆虫取食和机械诱导的烟草防御反应差异[19]及不同龄期虫体的解毒能力[39]有关。而有关以上不同处理下虫体解毒酶活性变化差异所涉及的分子生物学机制还需深入研究。

4 结论

不同虫害诱导处理烟株在一定程度上影响了后取食者斜纹夜蛾的取食及解毒酶系代谢机制，其中烟蚜取食和机械打孔诱导处理的烟叶对斜纹夜蛾幼虫具有明显的吸引取食作用，初孵幼虫则避免选择取食斜纹夜蛾诱导处理的烟叶；喂食各诱导抗性处理烟叶均可诱导激活斜纹夜蛾体内AchE活性升高，而对CarE、GST和MFO等3种酶活性则存在不同程度地激活或抑制作用，说明虫害诱导烟草抗性能改变斜纹夜蛾的取食选择，面对不同诱导抗性烟草，斜纹夜蛾体内的各解毒酶活性变化具有特异性。