甜高粱EMS诱变获得新种质的研究

王 炜 陈 琛 葛玉彬 罗俊杰 叶春雷

(1 甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃 兰州 730070；2 甘肃省农业科学院作物研究所，甘肃 兰州 730070)

甜高粱(SorghumbicolorL. Moench)为粒用高粱的变种，是一种重要的饲草作物和能源作物[1-2]。甜高粱具有生物量大、茎秆含糖量高、抗旱耐盐碱等优点，适合在降水稀少、盐碱地、贫瘠和边际土地中种植[3-4]。近年来随着人民生活水平的持续提高，人们对肉蛋奶等产品的需求日益扩大，国家适时推出农业供给侧改革，为促进畜牧业的快速发展，调整种植业结构[5]。此外，甜高粱是生产生物乙醇的主要作物之一，具有抗逆、耐瘠薄等特性，符合我国在“不与粮争地，不与人争粮”的原则下发展非粮生物质能源的政策导向[6]。因此，作为能饲兼用的甜高粱在我国农牧业的产业调整中具有重要意义，其中甜高粱种质资源创制及新品种培育是一项重要的基础性工作。

甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)是一种最常用化学诱变剂，其操作简单易行、诱变效果好速度快，诱变产生的突变体主要是单基因突变，诱变后代材料稳定，因此EMS诱变已被广泛应用于小麦[7-9]、大麦[10-11]、花生[12-13]、黄瓜[14-15]、亚麻[16-17]等多种作物的种质资源创制和突变体库构建。在高粱上，研究者采用EMS诱变获得了具有矮秆[18-21]、多分蘖[18]、早熟[19-20]、不育[22-23]等特性的突变体，但大部分这些突变体仅为早期世代材料，性状尚未稳定，在基础研究中不能作为永久性材料保存而重复使用，在应用研究中则不能作为种质使用。因此，本研究以甜高粱自交系甜94为供试材料，采用EMS诱变技术进行甜高粱新种质的创制，以期获得可稳定遗传的特异性状突变体材料，为甜高粱新品种的选育及其功能基因组研究提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为甜高粱自交系甜94，由平凉市农业科学院高粱课题组提供。

1.2 方法

诱变剂EMS(分子式C3H8O3S，分子量124.16，M0880-5G)购自美国Sigma公司。采用WYT手持糖度仪(成都豪创光电仪器有限公司生产)测定含糖量；采用游标卡尺测量茎粗。

1.2.1 EMS诱变甜高粱适宜剂量与时间组合的筛选 参照Kim等[24]和董文科等[25]的方法，用磷酸缓冲液(0.1 mol·L-1，pH值7.0)分别配制0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的EMS溶液，以蒸馏水处理作为对照(CK)，终止溶液为1 mol·L-1的硫代硫酸钠(Na2S2O3)。选取饱满、大小一致的甜94种子，自来水冲洗5～10 min清除甜高粱种子表面的灰尘等杂质，蒸馏水冲洗3次，将种子置于滤纸上吸干表面水分，之后放入150 mL的三角瓶中，分别加入已配制好的EMS溶液120 mL，处理时间分为8 h和16 h，各3次重复。处理期间置于摇床中(转速60 r·min-1，温度25℃)，黑布覆盖摇床，防止EMS见光分解。诱变完成后，将置于摇床中的离心管取出，加入适量1 mol·L-1的Na2S2O3清洗1遍，再用浓度为100 mmol·L-1的Na2S2O3洗3遍，每次轻摇 5 min，将溶液倒掉，自来水冲洗5～6 h，之后用蒸馏水冲洗5次，每次5 min，以除去种子表面残留的EMS；将种子置于滤纸上吸干表面水分，自然风干后将处理后的种子放入铺有2层无菌滤纸的培养皿(培养皿直径10 cm)中，每个培养皿中加入5 mL蒸馏水，置于培养箱中暗培养(温度25℃)。观察种子萌发情况，2周后统计发芽率(germination rate，GR)、成苗率(plantlet survival rate，PSR)和致死率(lethality rate，LR)。将存活幼苗移栽入大田，1周后再次统计幼苗存活率。以致死率达到50%(半致死率)作为适宜的EMS诱变甜高粱的适宜浓度和时间组合[4,7]。

发芽率=发芽种子数/供试种子总数×100%

成苗率=苗存活数/供试种子总数×100%

致死率=(1-诱变成苗率/对照成苗率)×100%

1.2.2 甜高粱的EMS诱变处理 按照上述方法，于2015年3月26日取大小均匀一致、饱满的甜94种子5 000粒，用筛选的适宜EMS浓度以及时间处理组合进行浸种处理。处理后的种子点播于育苗穴盘中，浇足水后置于温室中(温度15～28℃)，每天以喷洒形式适量浇水。出苗后将诱变后成活的M1代移栽至甘肃省农业科学院兰州细胞工程育种试验地，大田覆膜，按行长6.4 m，行距和株距均为0.4 m移栽，每12行设2行对照，常规管理，开花前套袋自交，成熟后全部按单株收获。M2～M5代按株行育苗移栽，大田覆膜，常规管理，参考何振富等[26]的方法观察统计出苗率、中脉颜色、叶片大小、穗型等；并测定株高、单株鲜重等表型性状；测定茎粗、含糖量。淘汰与对照无显著差异的材料后按单株收获。M2代时随机选取200个诱变单株测定各性状，计算诱变株各性状的诱变系数(mutation index，MI)及分布频率(distribution frequency，DF)。

诱变系数=诱变株性状测定值/对照相应性状测定值

分布频率=处于某性状测定值区间内诱变植株的个数/总诱变植株数×100%

1.2.3 部分诱变株系品质检测 通过逐代鉴定筛选，至M5代时部分诱变株系已基本稳定，乳熟期取其中5份矮秆、早熟、高含糖量、白粒和散穗的代表性材料的地上部，用刀切至2～4 cm长后置于室内阴干，粉碎后装入自封袋，由甘肃省农业科学院农业测试中心对样品的部分品质指标进行测定。其中水分采用直接干燥法[27]，粗蛋白含量用凯氏定氮法[28]，粗淀粉含量用酸水解法[29]，粗脂肪含量用残余法[30]，钙含量用原子吸收分光光谱法[31]。

2 结果与分析

2.1 适宜的EMS处理浓度与时间组合

采用5个EMS浓度梯度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)和2个时间梯度(8 h和16 h)，共计10个组合，对甜高粱自交系甜94种子进行诱变处理。结果表明(表1)，浓度和时间对甜高粱种子发芽率、成苗率和致死率有明显影响，表现出较强的浓度依赖性。1.0%/8 h、0.8%/16 h、1.0%/16 h 3种处理组合情况下成苗率均为0，致死率为100%；当处理组合为0.2%/16 h时，甜94的致死率为51.04%，接近于半致死剂量，因此可确定0.2%/16 h为较适宜的甜高粱EMS诱变处理组合。

2.2 诱变甜高粱M1代的出苗、移栽和田间表现

EMS处理后共计出苗1 762株，出苗率35.24%，移栽后成活1 607株，成苗率32.14%，致死率为62.18%。受到药物处理的原因，M1代诱变苗前期生长缓慢，出现许多畸形苗，生育期明显延长，有部分诱变苗育性丧失，因此有588株未能获得种子，10月下旬收获时仅结实1 019株，结实率为63.41%。对照甜94呈纺锤形穗、穗型中紧、籽粒红色、生育期140.00～155.00 d、株高280.00～315.00 cm、茎粗1.09～1.42 cm、叶面积482.00～520.00 cm2、千粒重7.50～11.30 g；与对照相比，诱变甜高粱M1代部分植株在生育期、株高、叶部、穗部、茎部、籽粒颜色和大小等性状方面均发生明显变异(表2)。

2.3 诱变甜高粱M2代的田间表现

M2代种子(M1代1 019株的籽粒)在温室育苗后，按株行全部移栽于覆膜大田。随机选取200份材料测定其生育期、株高、叶面积、茎粗、分蘖数、鲜重、含糖量等7个指标(表3)。结果表明，诱变甜高粱M2代生育期、株高和鲜重3个性状的平均值分别为126.28 d、225.69 cm、0.25 kg，生育期较对照平均提前21.12 d，株高较对照平均降低66.71 cm，单株鲜重则降低0.10 kg。其他性状方面则与对照差异较小。

表1 不同EMS浓度和处理时间对甜94种子发芽及成苗的影响Table 1 Effects of different EMS treatmenTCombinations on seed germination and plantlet survival of sweet sorghum Tian94

表2 诱变甜高粱M1代植株变异表型性状Table 2 Phenotypic variation of some EMS induced sweet sorghum plants in M1 generation

表3 诱变甜高粱M2代性状表现Table 3 Some traits of EMS induced sweet sorghum in M2 generation

进一步参照连续变数的次数分布统计方法，将各性状诱变系数(即该性状的测定值与对照平均值的比值)以不同组距分成组区间，制作成次数分布频率表(表4)。结果表明，81%的诱变株生育期较对照提前，90%的诱变株株高较对照降低，88%的诱变株鲜重较对照降低，这与上述结果相吻合；同时也提示这些材料在控制生育期、株高、鲜重等方面的基因可能发生了突变；而茎粗、叶面积、分蘖数呈现近正态分布。

2.4 诱变甜高粱M3～M5代逐代鉴定筛选

在M3～M5代继续进行了表型观察及部分性状鉴定，通过逐代筛选，在M5代获得已经基本稳定的早熟品系2份、高含糖量品系4份、矮秆品系6份、白粒品系3份、散穗品系3份(表5)。从表中可以看出，早熟材料ZS1和ZS2分别较对照提早成熟38.14和44.14 d；高含糖量材料TG1、TG2、TG3、TG4的含糖量均在23.01%以上，较对照提高6.36个百分点(对照一般在16%～18%之间，平均16.65%)；矮秆材料AG1、AG2、AG3、AG4、AG5、AG6株高较对照降低59.02%～63.62%；白粒、散穗等材料除了粒色和穗型不同外，其余性状与对照均无显著区别。

从18份M5代诱变系中选择具有代表性的早熟、高含糖量、矮秆、白粒及散穗各1份，对其品质相关指标进行检测(表6)。结果表明，水分含量均较对照有所降低，说明这些材料的相对干物质量增加；1份材料的粗蛋白含量较对照有所增加，1份持平，其余略有降低；其中1份材料(TG1)的粗淀粉含量较对照提高；所有诱变系的粗脂肪含量均较对照增加；早熟材料ZS1中钙含量达到640 mg·kg-1，较对照提高1.78倍，其余材料则较对照有所降低。尤其是TG1的水分含量、粗蛋白含量、粗淀粉含量、粗脂肪含量等4项指标均优于对照，是一份具有开发利用潜力的材料。

表6 部分诱变甜高粱M5代性状表现Table 6 Some traits of EMS induced sweet sorghum in M5 generation

3 讨论

EMS诱变具有操作简单易行、突变频率高、诱变基因位点单一等优点，是进行植物突变体库构建和种质资源创制最常用的方法[32-35]。对于不同植物，甚至同一植物的不同基因型，适宜EMS诱变的处理条件并不一致[18-23, 32]。因此，在进行大规模诱变之前，需要研究诱变野生型材料的适宜EMS处理浓度和时间组合[36]。目前通常以EMS半致死率作为标准[32-34]。在高粱EMS诱变研究中，王春语等[19]、刘言龙等[20]和Xin等[37]以粒用高粱自交系BTx623种子为供体的研究结果显示，适宜的EMS处理浓度时间组合在0.10%～0.25%/12～20 h之间；白鸿雁等[38]和范昕琦等[39]的结果则表明不同基因型高粱对EMS敏感度不同，半致死浓度也不一致，用于不同基因型以及突变体筛选的适宜EMS浓度时间处理组合在0.20%～0.35%/10～15 h之间。本研究结果为0.20%/16 h，与上述研究结果相似。

通过对EMS处理的诱变后代(M1～M5)进行连续的逐代表型观察、鉴定和筛选，获得基本稳定的具有早熟、高含糖量等特性的甜高粱种质材料18份(表5)。这些材料总体较原野生型对照的生育期提前、株高、叶面积与鲜重降低，这可能与早期诱变世代中若干材料因晚熟而未能结实而被自然淘汰、同时大部分株高较高的材料一般较晚熟等因素相关。在品质方面，所有材料的含糖量均超过对照，测定的5份材料中水分含量低于对照，而粗脂肪含量超过对照(表6)。由此可见，这些诱变甜高粱材料在作为饲草和能源作物上，有产量(鲜重)降低的缺点，但在若干品质指标上则有所提高。因此这些材料的特异性状如早熟、矮秆、高含糖量、白粒、散穗等性状可作为甜高粱相关性状功能基因定位研究，而这些材料也可作为部分遗传改良的种质资源材料。

4 结论

本研究结果表明，适宜甜高粱自交系甜94号EMS诱变处理的干种子浸泡法浓度时间组合为0.20%/16h。与原野生型对照相比，本研究创制了在生育期、株高、含糖量等性状方面具有明显差异的突变种质材料18份，其中早熟2份、高含糖量4份、矮秆6份、白粒3份、散穗3份。这些突变材料为甜高粱遗传改良和功能基因研究提供了新种质和基础材料，相关诱变处理及诱变后代的逐代观察、鉴定和筛选等方法可为甜高粱EMS诱变育种研究提供借鉴。