异硫氰酸苄酯对于黄曲霉生长速率和产毒情况的影响

程 月 朱姗姗 刘 静 张世凯 翟晓松 刘 阳 赵月菊,*

(1 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2 山东农业大学食品与科学工程学院，山东 泰安 271018)

黄曲霉(Aspergillusflavus)是一种腐生真菌，易污染各类农产品，同时会产生具有强毒性和强致癌性的黄曲霉毒素(aflatoxins, AFT)，严重威胁人畜健康[1-4]。花生和玉米在种植、储藏和加工中受黄曲霉毒素污染严重，黄曲霉毒素污染超标事件时有发生。马皎洁等[5]对来自湖南和湖北等12个省的玉米及其制品共计650份样品进行了真菌毒素检测，结果发现,玉米黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的检出率为53.02%，且有10.53%的玉米样品中AFT含量超出国家标准。高秀芬等[6]调查全国主要花生和玉米产区的AFT污染情况发现，6个产区的花生AFB1污染率较严重，污染率接近60%，AFB1污染平均含量为91.74 μg·kg-1；在全国6个省抽取279份玉米样品，AFB1检出率高达75.63%，在抽检的七类食品中，花生、玉米的检出率最高[7]。2015年在我国农产品出口欧盟的251个违例事件中，花生中的AFT超标事件高达98起，占39.0%，2014年违例事件167起，其中花生AFT超标事件36起，占21.6%[7]。AFT污染给我国农产品加工和出口造成了巨大的经济损失。目前主要通过抑制黄曲霉菌的生长和毒素的形成来解决AFT污染。其中应用防霉剂是控制黄曲霉毒素污染的一种有效方式，通常采用的防霉剂主要是人工合成类杀菌剂，如咪唑类，虽然效果良好，但具有毒副作用、易残留、降解周期长等缺点，限制了这类杀菌剂的使用范围及剂量[8-10]。因此，亟待开发新型安全无残留的防霉杀菌剂，从而有效控制黄曲霉污染。

异硫氰酸酯(isothiocyanates, ITCs)是一类具有R-N=S结构通式的化合物，是硫代葡萄糖苷(benzyl glucosinolate, BG)的酶解产物，天然存在于十字花科、番木瓜科植物中，例如萝卜、花椰菜、荠菜等[11]。异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate, BITC)是指R基团为苄基的一种异硫氰酸酯。BITC已被证明是安全无毒的，广泛用于降低血糖、血脂和抗癌[12]。Azaiez等[13]通过体外试验验证了3种异硫氰酸酯对真菌的抑制作用，发现3种异硫氰酸酯可以作为天然防腐剂应用在面包或易受串珠镰刀菌污染的食品中。Mejia-Garibay等[14]在液体培养和熏蒸条件下发现了黑芥末精油(异硫氰酸烯丙酯为其主要成分)可以抑制黄曲霉的活性。水分活度(water activity，aw)是影响霉菌生长与产毒的关键因素，但是目前关于aw对BITC抑制黄曲霉效果的影响鲜有报道。因此，本试验分别以花生和玉米为培养基质，研究不同浓度BITC在不同aw下对于黄曲霉生长和产毒情况的影响，旨在为进一步开发基于BITC的抑菌产品提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

A.flavusNRRL3357，由中国科学院微生物研究所提供；AFB1，美国西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；BITC，上海源叶生物有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent1260型高效液相色谱仪(配有AgilenTTC-C185 μm×4.6 μm×250 mm色谱柱)，美国安捷伦科技有限公司；LRH-150F型生化培养箱，广州番禹旭东坂田电子有限公司；SZ2-1LST型电子显微镜，日本Olympus公司；DRP-9052型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；LS-50HD立式压力蒸汽灭菌锅，上海森信实验仪器有限公司；D10-12型氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司；BSA124S型电子天平，德国Sartorius公司；Aqualab 4TE水活度测定仪，美国Decagon Devices公司；光化学衍生器，北京华安迈克生物有限公司；SK06G超声波清洗器，上海可导超声仪器有限公司。

1.3 培养基

玉米培养基：称取40 g玉米，碾碎成粉末后加入甘油和去离子水定容至1 000 mL，通过调节甘油和去离子水的添加比例控制培养基水分活度为0.995、0.980、0.960、0.930[15]，加入20 g琼脂粉，121℃高压灭菌30 min。

花生培养基：称取40 g花生，碾碎成粉末后加入甘油和去离子水定容至1 000 mL，通过调节甘油和去离子水的添加比例控制培养基水分活度为0.995、0.980、0.960、0.930[15]，加入20 g琼脂粉，121℃高压灭菌30 min。

自制马铃薯培养基(potato dextrose agar，PDA)：200 g去皮马铃薯煮沸30 min，纱布过滤固体物质取滤液，加入20 g葡萄糖和16 g琼脂粉，用蒸馏水定容至1 000 mL，115℃高压灭菌30 min。

1.4 孢子菌悬液的配制

将甘油保藏的黄曲霉菌株接种到PDA培养基上，放置在28℃生化恒温培养箱中培养5 d，待培养基表面长满黄曲霉绿色菌丝后，取出培养基，在PDA培养基上加入1 mL 0.1%吐温80溶液，使用无菌棉签挑取黄曲霉孢子至1%吐温80溶液制成均匀的孢子菌悬液中，用血球平板计数，调至浓度107CFU·mL-1待用。

1.5 BITC溶液的配制

将BITC溶于乙醇，采用梯度稀释法配制所需溶液[16]。

1.6 BITC抑制黄曲霉效果的分析

将黄曲霉孢子悬液接种于花生培养基中央，平板倒置，将一无菌圆形滤纸片(直径20 mm)贴在另一平板中央，取一定量的BITC配制溶液于滤纸片上，使花生培养基平板内精油浓度分别为0、5、10、15、20 mg·L-1，加入等量乙醇作为对照组。同样的方法接种黄曲霉于玉米培养基，使其浓度为0、2.5、5.0 mg·L-1。然后用封口膜密封平板，28℃培养7 d后测量菌落直径，直径反映了菌丝生长速率。BITC的体外抑菌效果分别采用菌落直径和抑菌率来表示。抑制率100%的最低精油浓度为其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)，每个处理3个重复。

抑菌率与菌落直径的换算公式为：

(1)。

1.7 AFB1的提取和检测

抑菌效果测定后，提取黄曲霉毒素。取培养基平板，用6 mm打孔器分别从中心、外缘和中间部位打3个菌饼置于5 mL离心管，加入1.5 mL氯仿，震荡30 min后8 000 r·min-1离心10 min取下层液体，60℃氮吹，用1 mL甲醇复溶。复溶之后的溶液用0.22 μm滤膜过滤到棕色液相进样瓶中，直接上样。

高效液相色谱分析条件：C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；荧光检测器2475型，激发波长360 nm，发射波长：440 nm；柱温：30℃；流动相：以甲醇∶水(7∶3, v∶v)为流动相；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1[17]。

(2)。

1.8 扫描电镜观察BITC对黄曲霉菌丝形态变化的影响

取aw为0.98的花生培养基中BITC(10 mg·L-1)处理3 d的黄曲霉菌丝和对照菌丝，用2.5%戊二醛溶液固定24 h，浓度为50%、75%、100%的乙醇各脱水20 min。通过临界点干燥法干燥样品，进行喷金处理[18]。扫描电镜下观察并拍照。

1.9 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0方差分析(ANOVA)分析试验数据，使用最小显著差异法(least significant difference，LSD)进行显著性分析(P<0.05)；采用 Origin Pro 2017C 64Bit软件绘图。

2 结果与分析

2.1 BITC对黄曲霉生长速率的影响

2.1.1 BITC在不同aw对黄曲霉生长速率的影响 (以花生为培养基质) 黄曲霉等曲霉属丝状在适宜的固体培养基表面常形成肉眼可见的菌落，并产生大量孢子，通过传播扩散进一步生长繁殖。由图1可知，在同一aw下(除0.930外)，BITC浓度不同，黄曲霉生长速率差异显著(P<0.05)。在设置的4个aw下，黄曲霉的生长速率均随着BITC浓度的增大而减小，且aw降低也会抑制黄曲霉的生长。当花生培养基质aw为0.930时，BITC对黄曲霉的MIC值最小(5 mg·L-1)。表明以花生为培养基质，BITC具有抑制和减弱黄曲霉菌丝径向生长和菌落形成的能力，并且具有明显的浓度-效应和水分活度-效应关系。

注：同一水分活度下，不同字母代表不同浓度BITC 之间差异显著(P<0.05)。下同。Note: For the same water activity, different letters represent significant differences between differenTConcentrations of BITC (P<0.05). The same as following.图1 以花生为培养基质，BITC对不同水分活度下 黄曲霉生长速率的影响Fig.1 Effect of different dose of BITC on growth rate of A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.1.2 BITC浓度在不同aw下对黄曲霉生长速率的影响 (以玉米为培养基基质) 由图2可知，同一aw下BITC处理浓度不同，黄曲霉的生长速率有显著差异(P<0.05)。在4个水分活度下，黄曲霉的生长速率均随着BITC处理浓度的增大而减小。在BITC未处理的玉米培养基质中，黄曲霉的生长速率随水分活度的降低而减小，在培养基质aw为0.930时，BITC对于黄曲霉有较好的抑菌效果，其MIC值为2.5 mg·L-1。表明以玉米为培养基质，BITC具有显著影响黄曲霉径向生长和菌落形成的作用，并且具有明显的浓度-效应和水分活度-效应关系。

图2 以玉米为培养基质，BITC对不同水分活度下 黄曲霉生长速率的影响Fig.2 Effect of different dose of BITC on growth rate of A. flavus at different aw with maize as the medium substrate

2.2 aw和培养基基质对BITC抑制率的影响

2.2.1 aw对于BITC抑制率的影响 (以花生为培养基质) 由表1可知，不同aw对BITC抑制黄曲霉生长的抑制率有显著差异(P<0.05)。aw越小，BITC对黄曲霉生长的抑制率越大。在5和10 mg·L-1BITC处理的花生培养基基质中，aw为0.930时可以完全抑制黄曲霉的生长；在15 mg·L-1BITC处理的基质中，aw为0.960时完全抑制黄曲霉的生长；而20 mg·L-1BITC处理的基质，aw为0.980时就可完全抑制黄曲霉的生长，黄曲霉的MIC值随着水分活度的减小而减小。

2.2.2 培养基质对于BITC抑制率的影响 由表2可知，在5 mg·L-1BITC处理条件下，同一aw(0.960、0.980和0.995)下，不同培养基基质对BITC抑菌率有显著影响(P<0.05)，以玉米为培养基基质BITC的抑菌率大于以花生为培养基基质。以花生和玉米为培养基基质完全抑制黄曲霉的生长的aw分别为0.930和0.995。

2.3 BITC对黄曲霉产毒的影响

2.3.1 BITC浓度和水分活度对黄曲霉产毒的影响 (以花生为培养基质) 由图3可知，以花生为培养基基质，在较高aw(0.995和0.980)下，AFB1含量随着BITC浓度的增加呈先上升后下降的趋势。而在较低aw(0.960和0.930)下，BITC浓度的增大会导致AFB1含量降低。并且随着aw的降低，黄曲霉产毒被完全抑制所需的BITC浓度越来越低，aw为0.930时，BITC浓度仅需5 mg·L-1就可以完全抑制黄曲霉的产毒。当使用相同的BITC浓度时，aw降低会进一步抑制黄曲霉产毒。

表1 以花生为培养基基质，水分活度对不同BITC浓度抑制黄曲霉抑制率的影响Table 1 Effect of different aw on inhibition rate of A. flavus with peanut as the medium substrate /%

表2 5 mg·L-1 BITC处理条件下，培养基质对BITC 抑制黄曲霉抑制率的影响Table 2 Effect of medium substrate on inhibition rate of BITCAgainst A. flavus under 5 mg·L-1 BITC treatment /%

图3 以花生为培养基质，不同浓度BITC在 不同水分活度下对于AFB1含量的影响Fig.3 Effect of different dose of BITC on AFB1 by A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.3.2 BITC浓度和水分活度对于黄曲霉产毒的影响 (以玉米为培养基质) 由图4可知，在同一aw下，黄曲霉产毒浓度随着BITC浓度的增大而减小。在相同BITC浓度下，aw的减弱会进一步抑制黄曲霉毒素的产生。在aw为0.995、0.980和0.960时，BITC浓度在5 mg·L-1时其产毒被完全抑制；在aw为0.930时，BITC浓度在2.5 mg·L-1时可以完全抑制黄曲霉产毒。

图4 以玉米为培养基质，BITC浓度在 不同水分活度下对于AFB1含量的影响Fig.4 Effect of different dose of BITC on AFB1 by A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.4 BITC对黄曲霉菌丝形态变化的影响

由图5-A、B可知，扫描电镜下观察到未添加黄曲霉的菌丝表面光滑、圆润，呈杆状，经BITC处理72 h后，黄曲霉的菌丝形态有明显变化，菌丝表面有明显破损并且有粘连趋势。宏观形态观察结果表明，BITC处理可明显抑制黄曲霉的生长(图5-a、b)。

注：微观形态：A为未用BITC处理的黄曲霉，B为使用BITC处理的黄曲霉；宏观形态：a为未用BITC处理的黄曲霉，b为使用BITC处理的 黄曲霉。Note: Microscopic morphology: A: Aspergillus flavus without BITC treatment, B: Aspergillus flavus treated with BITC. Macroscopic morphology: a: Aspergillus flavus without BITC treatment, b: Aspergillus flavus treated with BITC.图5 BITC对黄曲霉形态的影响Fig.5 Effect of BITC on the morphology of A. flavus

3 讨论

目前国内外对BITC杀菌防霉作用的研究取得了一些进展，Isshiki等[19]测定了BITC抑制霉菌、细菌和酵母菌的生长情况，结果表明虽然其对各种病原微生物的抑制效果有差异，但都具有抑制作用。张建佳等[20]以微小枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为模式菌株，以未添加BITC为对照组，通过测定微生物的生长曲线，发现在不致死细菌的浓度下控制BITC的加入可以延长微生物的延滞期，并认为BITC对细菌生长有一定的抑制作用。本研究也证实了BITC对黄曲霉有良好的抑菌作用，且抑菌效果与其浓度呈正比。

此外，有研究表明黄曲霉的生长速率与基质的aw有关[21-22]。本研究也表明aw越低，BITC的抑菌活性越强，这可能是由于水分活度的降低会使培养基质内蒸气压升高，导致BITC的抑菌能力增强[23]。此外，本研究也证明了BITC在玉米培养基质中的抑菌活性比在花生培养基质中强，这可能是由于玉米中的糖含量高于高于花生，糖在基质中也可以作为一种防腐剂[24]，但是随着aw的降低会弱化培养基基质对BITC抑菌性的影响。

另外，本研究结果还表明，低aw也会抑制黄曲霉产毒，这与Ahmed等[25]研究黄曲霉在其他培养基上的产毒情况一致。Antonia等[26]研究发现，黄曲霉在杏仁培养基中aw与黄曲霉的产毒成正比。此外，本研究在aw为0.995花生培养基质内用BITC熏蒸黄曲霉，其产毒呈现先上升后下降的趋势。Sonia等[27]研究表明，玉米中牛蒡、玫瑰草和香茅、肉桂精油在高aw(0.995)下对于镰刀菌产毒的抑制效果不明显，甚至有促进产毒作用。这可能由于逆境中的微生物倾向于合成更多的次级代谢产物[28]。本研究中，BITC熏蒸可能造成了一个逆境环境，从而可能出现黄曲霉的产毒能力增加的现象。在较低aw下(0.980、0.960和0.930)的花生培养基质随着BITC处理浓度的增加，黄曲霉的产毒能力下降。在以玉米为培养基基质时，BITC浓度的增加和水分活度的下降均会抑制黄曲霉产毒。

扫描电镜观察到菌丝形态受到严重破坏，发生了表面黏连、不平整、皱缩等一系列变形,这是由于BITC破坏了黄曲霉菌丝体细胞壁结构，使黄曲霉不能维持细胞固有形态，阻止菌丝体的生长[29]，其内在机制可能是BITC的强疏水性造成细胞膜流动性发生变化，从而导致细胞内渗透压不平衡，抑制其酶促反应、内容物泄露，最后造成细胞膜破裂，细胞死亡[30]。

4 结论

本研究表明，BITC能够显著抑制黄曲霉的生长和产毒，同时具有浓度-效应、培养基-效应和水分活度-效应关系。BITC在培养基低aw时具有更强的抗菌活性，这为BITC增强抗菌活性提供了一种手段。在aw为0.930时，较花生培养基质，以玉米为培养基基质时黄曲霉可以取得较小的MIC值(2.5 mg·L-1)。当花生培养基质高aw(0.995，0.980)条件下，低BITC浓度会促进黄曲霉的产毒，这是投入使用BITC时需要注意的问题，也提示仅抑制黄曲霉的生长来控制黄曲霉的产毒是不科学的。