血浆miR-195对早期急性心肌梗死的诊断价值及可能机制的生物信息学分析

张淑华，陈延宇，刘燕锋，王云霞，姚宇迪，吴志勇

1江西省人民医院（南昌医学院第一附属医院）心血管病研究所，南昌 330006；2南昌大学医学院；3南昌大学第一附属医院高新医院中心实验室

急性心肌梗死（AMI）是全球病死率较高的疾病之一，准确的早期诊断和及时的血运重建可以修复缺血心肌，降低病死率，改善患者预后。一直以来，心肌肌钙蛋白I（cTnI）被认为是临床诊断AMI的“金标准”，可用于早期诊断AMI，从而提高治疗效果［1］。然而，在AMI患者中，cTnI水平最早在胸痛发作3.5 h后升高，在血液中能被检测到升高的时间相对“延迟”。而且非AMI患者如不稳定型心绞痛、主动脉夹层、肺栓塞、终末期肾功能不全、心肌炎、心力衰竭等，cTnI水平可非特异度升高［2］。非编码微小RNA（miRNA）广泛存在于各个进化阶段的生物体中，具有高度的保守性、时序性和组织特异度。miRNA在心肌高表达或特异表达参与心脏发育、心律失常、心肌肥厚及心力衰竭等多种心脏生理和病理过程［3］。此外，生物信息学可有效筛选与预测疾病的关键基因。为此，本研究欲探讨miR-195在AMI患者血浆中的表达变化，并结合生物信息学评价其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年6月—12月在江西省人民医院心内科住院治疗的AMI患者100例（AMI组），男68例、女32例，年龄41～61岁。纳入标准：符合中华医学会心血管病学分会制定的AMI诊断标准［4］，并均在症状出现24 h内入院，无心肌梗死或经皮冠状动脉介入史。排除标准：合并血液系统疾病、急性或慢性感染性疾病、严重肝肾功能不全、瓣膜性心脏病、周围血管性疾病、肿瘤等疾病。另同期选择门诊体检健康的60例志愿者为对照组，排除心脑血管疾病，男39例、女21例，年龄44～62岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。本研究经江西省人民医院医学伦理委员会批准（2018026），受试对象均签署知情同意书。

1.2 血液标本采集 采集AMI组胸痛4～6 h、＞6～8 h、＞8 h及对照组体检当日晨外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸二钠抗凝管中，4℃下2 000 r/min（半径10 cm）离心10 min，收集血浆，置于-80℃储存备用。

1.3 血浆cTnI检测 采用固相免疫层析法检测受试者血浆cTnI，以0.5 ng/mL为检测临界值，试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。

1.4 血浆miR-195表达检测 按照miRNeasy kit试剂盒说明书（No217184，Qiagen）提取血浆标本总RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo Fish Scientific公司）测定RNA样品的浓度和纯度。采用Taqman miRNA荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒（美国ABI公司）及miRNA特异度茎环结构引物进行反转录—实时定量PCR，选择人工合成的线虫cel-miR-39作为外源性参照，在ABI7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行PCP扩增。miR-195上游引物5'-GATAGCAGCACAGCAATATTAGC-3'、下游引物5'-CAGTCCGTGTCGTAGAGT-3'；cel-miR-39上游引物5'-GACTTCATCCGGGTGTAAATC-3'：下 游 引 物5'-TATCGTTCTCCACTCCTTCAC-3'。反应条件：95℃5 min，95℃15 s、60℃60 s循环40次。每个样本重复实验3次，取平均Ct值。同时以不含RNA模板的ddH2O作为阴性对照。用2-ΔΔCt法计算miR-195相对表达量。

1.5 miR-195靶基因与AMI相关基因匹配及筛选 运用miRDB和miRWalk两个miRNA靶基因预测数据库分别获得miR-195的靶基因1 419和7 684个。同时在Geencards数据库以“acute myocardial infarction”为关键词检索获得1 544个相关基因。通过Venny2.1.0对上述三个数据库中的基因集进行交集处理，初步获得70个miR-195可能作用于AMI的潜在靶基因。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8将已获得的70个交集基因取交集进行基因本体数据库（GO）富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，Cytoscape3.7.2软件对主要交集基因—信号通路进行可视化分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。服从正态分布的计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。采用受试者特征曲线分析血浆miR-195对AMI的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMI组不同时点与对照组血浆miR-195相对表达量、cTnI比较 见表1。

表1 AMI组不同时点与对照组血浆miR-195相对表达量、cTnI比较（±s）

表1 AMI组不同时点与对照组血浆miR-195相对表达量、cTnI比较（±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05；与胸痛4～6 h AMI组比较，#P＜0.05。

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2.2 血浆miR-195联合cTnI对AMI的诊断效能 miR-195对AMI诊断的曲线下面积为0.94，最佳截断值为0.85，敏感度为90.0%，特异度为94.7%；cTnI对AMI诊断的曲线下面积为0.86，最佳截断值为0.54 ng/mL，敏感度为85.0%，特异度为68.4%；miR-195联合cTnI对AMI诊断的曲线下面积为0.96，敏感度为91.0%，特异度为93.0%。

2.3 miR-195与AMI相关的基因 初步获得70个miR-195可能作用于AMI的潜在靶基因。为确保通路的正确性，仅将每种富集结果中评分排名前三的通路纳入分析范围，结果显示miR-195可能通过影响心肌细胞凋亡的负向调控通路（GO：0043066）参与AMI的 发 生 发 展，BCL-2、MAPK8、RAF1、IGF1、NOTCH2、IKBKB、PTEN、VEGFA、PDCD1、CCND2等10个基因富集于该通路。见图1。

图1 miR-195与AMI相关交集基因—主要信号通路网络图

3 讨论

miRNA通过诱导靶基因mRNA降解或抑制蛋白质翻译控制基因转录后表达，从而发挥生物学功能。miRNA在心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭、动脉粥样硬化等心血管疾病中具有重要作用［3］。这些潜在作用改变了我们以往对心血管疾病的认知，并为疾病的预测、诊断及治疗提供了新策略。

AMI发病迅速、致死率极高，及时有效地诊断与治疗是降低病死率、改善预后的关键。cTnI是心肌特有的结构蛋白，对心肌损伤有较高的敏感度和特异度，也是目前临床诊断AMI常用的指标。研究表明，cTnI仅存在于心肌细胞中，主要与肌原纤维结合，当心肌细胞损伤时从心肌纤维上降解下来释放到血液中，因此，血清中cTnI的水平升高可反映心肌细胞受损［2］。

miRNA主要是与胞质中的蛋白质复合物结合，当细胞损伤时，miRNA能以更快的速度释放到血液中，并可在一定时间内稳定存在于循环体液中。这奠定了miRNA作为早期AMI生物标志物的基础。基于循环miRNA高稳定性及不易被降解的优势，多种循环miRNA已被报道在AMI早期表达失调，且早于传统生物标志物CK和cTnI等［5-6］。研究显示，AMI患者血浆miR-195表达在胸痛发作后8、12 h均升高［7］。然而，该研究样本量少，且未能检测到胸痛发作后更短时间内miR-195的变化。本研究纳入100例AMI患者，结果显示患者胸痛发生4 h血浆中即可检测到miR-195相对表达量升高，且随着胸痛时间的增加，miR-195表达有增加趋势。miR-195联合cTnI诊断AMI的敏感度及特异度分别为91.0%、93.0%，均高于cTnI，提示循环miR-195联合应用于诊断AMI，可有效提高cTnI的诊断效能。

miR-195是miR-15a/15b/16/195/497家族中的重要一员，人miR-195基因定位于染色体17p13.1区域，距离抑癌基因p53仅650 kb，该区域常发生杂合性缺失。其在肿瘤发生发展、细胞增殖凋亡、侵袭迁移、耐药形成及预后等多方面发挥重要作用［8］。Bcl-2及RAF1是miR-195的代表性靶点［9］。本研究分析获得70个miR-195靶向AMI的潜在靶基因，通过GO功能和KEGG通路分析发现，miR-195可能通过影响细胞凋亡的负向调控通路进而影响AMI。富集于凋亡负向调控通路的靶基因有Bcl-2、MAPK8、RAF1、IGF1、NOTCH2、IKBKB、PTEN、VEGFA、PDCD1、CCND2，这些基因曾被报道参与了AMI中心肌细胞凋亡［10-14］。

综上所述，在AMI早期血浆miR-195表达升高，miR-195的作用机制主要与心肌细胞凋亡相关。这也提示miR-195不仅可作为心肌梗死早期诊断的生物标志物，且有望成为AMI治疗的潜在靶点或预后的评价指标。