激光辅助孵化技术在冷冻复苏周期囊胚移植中的应用

崔亭亭，纪昌丽，杨阳，晁岚

1山东大学齐鲁医学院，济南 250012；2山东大学齐鲁医院妇产科生殖医学中心

玻璃化冷冻技术的出现使得囊胚的冷冻效率及复苏成功率大大提高。然而研究显示，胚胎在冷冻及解冻过程中，透明带（ZP）的张力会变差，弹性会降低，从而导致胚胎孵出困难［1］。众所周知，囊胚形成后适时从ZP中孵出是胚胎在宫内种植的先决条件［2］，因此，有学者提出对冷冻胚胎进行辅助孵化（AH）。激光AH即利用激光在ZP上操作，从而帮助胚胎从ZP中孵出。关于激光AH能否改善复苏周期囊胚移植的妊娠结局，至今仍存在争议［3-4］。我们分析444例复苏周期囊胚移植患者的资料，观察激光AH在复苏周期囊胚移植中的作用，为激光AH技术在临床中的应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年6月—2016年12月在山东大学齐鲁医院行复苏周期囊胚移植的患者444例，入选标准：移植胚胎数为1～2枚；采用自然周期（NC）方案或激素替代方案（HRT）准备内膜；年龄≤40岁；所移植囊胚均为前1天复苏，过夜培养18～20 h，次日移植。排除标准：夫妇双方任一方存在染色体异常；子宫畸形；临床资料不完整。其中，2014年1月—2015年5月，行复苏周期囊胚移植且未行激光AH的患者194例，作为NAH组；2015年6月—2016年12月，行复苏周期囊胚移植且行激光AH的患者250例，作为AH组。本研究经过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 囊胚的玻璃化冷冻及解冻 采用KITAZATO玻璃化冷冻液套装和玻璃化解冻套装，按照操作规程进行冷冻及解冻操作。囊胚解冻后，继续培养18～20 h后行胚胎移植。玻璃化冷冻：将囊胚放到平衡液表面，使其自然下沉平衡5 min；将囊胚移入冷冻液1不同位置中快速洗涤，反复洗涤30～40 s；装管，1～2枚胚胎/管，保留少许液体，胚胎装载完成后，投入液氮中。玻璃化解冻：在37℃下，迅速将冷冻载杆从液氮中取出并直接投入复苏液1中1 min，快速解冻；在室温下，将胚胎移到复苏液2表面，使其自然下沉，计时3 min；在室温下，将胚胎移到洗涤液1使其自然下沉，计时5 min；在室温下，将胚胎带尽可能少的液体量转移到洗涤液2，计时5 min；将胚胎转移到预先平衡过的培养液中，移至带有激光的倒置显微镜下，行AH。

1.3 激光AH 打开激光发射器（型号：OCTAX Laser ShotTM，德国）的电源，待激光发射器初始化完成后，调节激光的脉冲时间5～8 ms，将激光镜头调至看清楚胚胎ZP，并将激光发射点对准沿着ZP安全区域，削除范围为ZP周长的1/8。

1.4 胚胎移植 月经周期规律且排卵正常者采用自然周期方案，排卵后第5天移植囊胚；自然周期无排卵或排卵不规律者采用激素替代周期方案，于月经第19天复苏囊胚，月经第20天移植囊胚。

1.5 结局观察

1.5.1 囊胚孵化程度 采用Gardner评分系统对囊胚分期进行评价［5］。1期：早期囊胚，囊胚腔小于胚胎体积的1/2；2期：囊胚，囊胚腔大于等于胚胎体积的1/2；3期：完全囊胚，囊胚腔充满整个胚胎；4期：扩张囊胚，囊胚大于早期胚胎，ZP变薄；5期：正孵出的囊胚，滋养细胞开始从ZP突出；6期：已孵出的囊胚，囊胚完全从ZP中孵出。

1.5.2 妊娠及新生儿结局指标 胚胎移植后12～14 d检测血清β-HCG水平，血β-HCG＞10 mIU/mL为生化妊娠；胚胎移植4～5周行B超检查，若在宫腔内见妊娠囊，为临床妊娠；妊娠＜28周或胎儿体质量＜1 000 g为流产；妊娠满28周后分娩且存活的新生儿为活产；妊娠满28周且不满37周为早产；出生体质量＜2 500 g为低出生体质量；出生体质量≥4 000 g为巨大儿。胚胎植入率=（孕囊总数/总移植胚胎数）×100%；生化妊娠率=（生化妊娠周期数/移植周期数）×100%；临床妊娠率=（临床妊娠周期数/移植周期数）×100%；活产率=（活产周期数/移植周期数）×100%；流产率=（流产周期数/临床妊娠周期数）×100%。

1.6 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。符合正态分布的计量资料用±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验。用二元Logistic回归模型调整混杂因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 两组年龄、BMI、不孕年限、基础FSH值、不孕类型、移植囊胚数比较差异无统计学意义（P均＞0.05）；AH组子宫内膜厚度薄于NAH组，自然周期方案占比高于NAH组（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 两组移植前囊胚孵化程度比较 囊胚解冻后继续培养18～20 h行胚胎移植，移植前AH组和NAH组的4、5、6期囊胚比例比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 两组移植前囊胚分期比较［例（%）］

2.3 两组妊娠结局比较 NAH组移植胚胎310个，AH组移植胚胎388个。用二元Logistic回归模型调整混杂因素，AH组的胚胎植入率、生化妊娠率、临床妊娠率、总活产率、单胎活产率均高于NAH组（P均＜0.05），两组的双胎活产率、流产率比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 两组妊娠结局比较［例（%）］

2.4 两组新生儿结局比较 AH组巨大儿12例（6.67%），新生儿出生体质量（3 058.67±715.94）g，早产儿60例（33.33%），低出生体质量儿29例（16.11%）。NAH组巨大儿18例（15.79%），新生儿出生体质量（3 130.18±752.79）g，早产儿28例（24.56%），低出生体质量儿19例（16.67%）。与NAH组比较，AH组巨大儿比例低（P＜0.05），两组新生儿出生体质量、早产儿比例、低出生体质量儿比例比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

3 讨论

研究发现，ZP的硬化可能与多种因素相关，如高龄、体外培养环境、冷冻—复苏过程［6］等。因此，有学者提出对冷冻胚胎进行AH来帮助其从ZP中顺利孵出。AH即利用人工的方法在ZP上打孔或削薄ZP来加速胚胎孵出。AH的方法有很多，如化学法、机械法和激光法等。其中激光法因其操作简单快捷、定位准确、成本低、受人为因素影响小，现已被大多数生殖中心所采用。

目前关于AH促进囊胚着床的机制尚不完全清楚，但可以从以下几点给出解释。AH加快了胚胎孵出的速度，延长了胚胎与子宫内膜的作用时间，从而改善胚胎与子宫内膜的黏附，胚胎与子宫内膜的同步性是胚胎着床的关键。此外，植入窗内的早期植入与随后的活产率相关，而延迟植入则与高流产率相关［7］。本研究纳入的群体均为复苏周期囊胚移植的患者，分为AH组和NAH组，其中AH组250个周期，NAH组194个周期。结果显示，AH组移植前囊胚孵化程度主要集中在5期和6期，而NAH组主要集中在4期和5期，进一步论证了AH可以加快囊胚孵出速度。此外，我中心均采取前一天复苏囊胚，次日移植的方式，从胚胎开始复苏到移植到患者体内间隔时长为18～20 h。

研究证实，通过ZP打孔法的激光AH可以改善冷冻-解冻胚胎患者的临床妊娠率和植入率［8］。本研究同样采用了激光打孔的AH法去除1/8周长ZP。此方法操作简易、不会损伤囊胚的滋养外胚层和内细胞团，且ZP开孔的大小有利于囊胚孵出。国外一项荟萃分析显示［9］，在有反复移植失败史或移植冷冻胚胎的患者中，AH能增加临床妊娠率和多胎妊娠率。本研究尚未统计多胎妊娠率的差异，但AH组的临床妊娠率高于NAH组。研究表明，人类辅助生殖技术中的活产率会随着囊胚扩张程度的增加而升高［10］。此外，囊胚扩张程度是预测成功率的指标［11］。基于以上结论，我们推测，AH组的妊娠率之所以高于NAH组，可能是因为AH加快了囊胚孵化，提高了囊胚扩张程度，使得胚胎在种植窗内着床的概率更大。本研究中两组研究对象的内膜厚度及内膜治疗方案存在差异，故采用二元Logistic回归分析法去除混杂因素影响后，AH组的上述几项指标（胚胎植入率、生化妊娠率、临床妊娠率、活产率）仍高于NAH组，说明AH可以改善复苏周期囊胚移植的妊娠结局。然而，一项纳入了2 165例冷冻囊胚资料的研究却认为AH与妊娠率的改善无关［3］；DEBROCK等［12］的研究也显示激光AH并不能提高胚胎植入率。这与我们的结果恰好相反，一部分原因可能来自于各中心AH的具体方式不同，如激光打孔法时开孔的大小以及不同的ZP削除范围等。ZHANG等［13］对比了不同减薄厚度的ZP（40、80μm）的妊娠率，发现80μm组的妊娠率和胚胎植入率明显高于40μm组。表明激光减薄ZP的大小可能影响冷冻-解冻卵裂期胚胎移植后的妊娠率和植入率。但激光AH对冷冻囊胚移植结局的影响仍需要进一步探讨。

有研究考虑到激光的热效应，质疑激光AH对后代的安全性［14］。我们的操作均由经验丰富的实验室人员在室温下进行，且将胚胎的体外暴露时间控制在一定范围内，因此热损伤的发生概率很低。此外，本研究结果也显示，两组新生儿出生体质量、低出生体质量儿比例、早产率差异并无统计学意义。这与JUNNA等［15］的研究一致。但AH组的巨大儿比例低于NAH组。对此，我们将AH组和NAH组按照不同内膜方案做了分层分析，排除基线资料差异后，各组内不同内膜方案的新生儿结局并未有显著差异。然而，最新的一项系统综述显示HRT方案相较NC方案，增加了子痫前期、产后出血、巨大儿及过期产等风险［16］。推测原因之一是HRT方案适用的群体多无正常排卵，因此无黄体产生，而黄体不仅能产生雌激素和孕激素，还可以产生血管活性产物（松弛素、血管内皮生长因子），它们对初始胎盘形成尤为重要。而缺乏黄体则会导致血管活性物质减少，降低动脉的顺应性，因此可能与妊娠期子痫前期的发生有密切关系［17］。此外，HRT方案需要外源性给予雌激素来促使内膜增长，然而胚胎滋养层细胞发育过程中大剂量雌激素可能会造成子宫螺旋动脉重塑异常，胎盘血供不足，进而增加了围产期母婴并发症概率［18］。

总之，激光AH总体改善了冷冻复苏周期囊胚移植的妊娠结局，且未会对新生儿造成不利影响。本研究的不足之处是纳入样本量偏小，未能统计两组的单卵双胎率和异位妊娠率等指标。故AH对妊娠结局的影响有待更大样本的研究来证实。