九香虫油脂提取条件优化及体外抗乳腺癌活性研究

于姮梅，赵 帅，蔡仁莲，田 莹，郭建军

(1.贵州大学 昆虫研究所，贵阳 550025； 2.农业农村部贵阳作物有害生物科学观测实验站，贵阳 550025)

昆虫是地球上最大的生物类群，具有种类多、数量大、繁殖速度快等特点，长期以来被人类作为食品、药品和化学原料利用[1]，其主要应用价值来自其体内丰富的蛋白质、油脂、碳水化合物等有机物质及多种无机物质[2]。昆虫因其油脂含量丰富、脂肪酸组成合理，是潜在的优质食用油脂源[3]。此外，昆虫油脂具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、改善记忆力、保护肝脏、预防心血管疾病等多种药理活性[4-10]，如：美洲大蠊和丝光绿蝇油脂具有良好的抗氧化活性[4]；大头金蝇幼虫油脂具有护肝和降血脂的功效[5-6]；黄粉虫油脂能够抑制小鼠增重，提高学习记忆力[7]；蚕蛹油脂具有降血脂、降血糖、抗氧化、改善记忆力、保护肝脏、预防心血管疾病等功效[8-10]。上述诸多研究为昆虫油脂药理活性的深入探索提供了有力的支持。

九香虫(AspongopuschinensisDallas，1851)是我国传统的药食两用资源昆虫，是我国部分地区传统的特色食品，同时现代医学证明其具有良好的抗癌功能[11-13]。九香虫油脂含量丰富[14-15]，李会芳等[16-17]采用正交实验对超临界CO2和石油醚回流提取九香虫油脂的工艺条件进行了优化，但总体来说，对九香虫油脂提取方法的研究还比较少。另外，对九香虫油脂相关药理的研究还比较缺乏。基于此，本研究采用索氏抽提法提取九香虫油脂，以油脂提取率为考察指标，以液料比、提取温度、提取时间为影响因素，采用单因素实验和正交实验对九香虫油脂的提取工艺进行了优化，以确定九香虫油脂的最佳提取条件；并以小鼠乳腺癌细胞4T1和人乳腺癌细胞HCC1937为研究对象，通过体外实验验证所提取九香虫油脂的抗乳腺癌活性，以期为九香虫油脂的高效提取及药用价值的深入挖掘提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 虫源及细胞来源

九香虫成虫，采自贵州省凯里市(东经107.80°，北纬26.52°)，洗净并用吸水纸吸干虫体表面水分，置于-80℃冰箱储存备用。小鼠乳腺癌细胞系4T1和人乳腺癌细胞系HCC1937，中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂

石油醚(沸程60～90℃，分析纯)，天津富宇精细化工有限公司；RPMI-1640培养基、丙酮酸钠溶液，美国Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青公司；青霉素-链霉素溶液，北京索莱宝科技有限公司；碳酸氢钠(分析纯)，天津市永大化学试剂有限公司；葡萄糖(分析纯)，成都金山化学试剂有限公司；0.25%胰蛋白酶，美国HyClone公司；PBS缓冲液，上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒，汉恒生物科技有限公司；无水乙醇(分析纯)，重庆川东化工有限公司。

1.1.3 主要仪器

Forma 900 series超低温冰箱、FORM3141型二氧化碳培养箱、Multislan GO酶联免疫检测仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；202型电热恒温干燥箱，北京永光明医疗仪器厂；JYS-M01磨粉机，九阳股份有限公司；BSM型电子天平，上海卓精电子科技有限公司；SZF-06A脂肪测定仪，上海昕瑞仪表有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Bio-Ⅱ-A/M生物安全柜，西班牙Telstar公司；IC1000自动细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司；AE20/21倒置相差显微镜，厦门麦克奥迪公司；Eppendorf移液器；Millex GP过滤器(0.22 μm)，美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 九香虫油脂的提取

取九香虫于65℃烘箱中烘干4 h，用磨粉机粉碎。称取5.0 g九香虫粉，用滤纸筒包裹后置于脂肪测定仪抽提器中，加入石油醚提取一定时间，旋转蒸发仪旋蒸回收溶剂后，置于50℃电热恒温干燥箱中烘干至恒重，得到九香虫油脂。按下式计算九香虫油脂提取率(Y)。

Y=m1/m0×100%

(1)

式中：m1为九香虫油脂质量，g；m0为九香虫粉质量，g。

1.2.2 九香虫油脂对乳腺癌细胞的影响

1.2.2.1 细胞培养及油脂预处理

小鼠乳腺癌细胞4T1与人乳腺癌细胞HCC1937于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，待细胞生长至培养瓶底70%～80%满时进入对数生长期，待用。

九香虫油脂和无水乙醇分别用0.22 μm过滤器过滤除菌备用。

1.2.2.2 形态学观察

取对数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1、人乳腺癌细胞HCC1937，用0.25%胰酶消化后，采用细胞计数器计数，调整细胞浓度至5×104个/mL(细胞悬液)。分别取100 μL细胞悬液接种于96孔培养板中，待24 h细胞贴壁后，加入九香虫油脂至终质量浓度分别为0、8、16 mg/mL(均含1%无水乙醇)，另设置阴性对照组(不含无水乙醇的完全培养液)，24 h后于倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.2.2.3 CCK-8法检测九香虫油脂对乳腺癌细胞增殖作用的影响

细胞前期处理同1.2.2.2，实验设置空白对照组(不加入细胞)。待24 h细胞贴壁后，加入九香虫油脂至终质量浓度分别为0、4、8、12、16 mg/mL(均含1%无水乙醇)，另设置阴性对照组(不含无水乙醇的完全培养液)，每组设置6个重复。24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于细胞培养箱中继续培养，4 h后使用酶标仪检测450 nm下吸光度(A)，按式(2)计算细胞增殖率(Y1)，并利用GraphPad Prism 8.0软件计算九香虫油脂对乳腺癌细胞4T1、HCC1937的半抑制浓度(IC50)。

Y1=(A1-A0)/(A2-A0)×100%

(2)

式中：A1为实验组的吸光度；A0为空白对照组的吸光度；A2为阴性对照组的吸光度。

1.2.3 数据处理

2 结果与讨论

2.1 九香虫油脂提取单因素实验

2.1.1 液料比的影响

在提取温度70℃、提取时间3 h条件下，考察不同液料比对九香虫油脂提取率的影响，结果见图1。

图1 液料比对九香虫油脂提取率的影响

由图1可见，随着液料比的增大，九香虫油脂提取率先逐渐上升后趋于稳定，在液料比为(6～8)∶1时，油脂提取率上升幅度不明显。考虑到有机溶剂用量过大，会导致后续旋蒸、挥发有机溶剂等工作量的增加，生产成本增加，故选取液料比6∶1为较优的提取条件用于后续实验。

2.1.2 提取时间的影响

在液料比6∶1、提取温度70℃条件下，考察不同提取时间对九香虫油脂提取率的影响，结果见图2。

由图2可见，九香虫油脂提取率随提取时间的延长先逐渐上升后趋于稳定。在提取时间为3～5 h时，油脂提取率变化不明显，且5 h时油脂提取率较4 h时略有降低，可能是由于提取时间过长九香虫蛋白质对九香虫油脂的反吸附所致[18]。从节约资源的角度出发，初步确定提取时间3 h为较优的提取条件用于后续实验。

图2 提取时间对九香虫油脂提取率的影响

2.1.3 提取温度的影响

在液料比6∶1、提取时间3 h条件下，考察不同提取温度对九香虫油脂提取率的影响，结果见图3。

图3 提取温度对九香虫油脂提取率的影响

由图3可见，60℃以下，由于提取温度过低未达到石油醚沸点而导致九香虫油脂提取率过低，随后随提取温度的升高油脂提取率逐渐上升，80℃以上时提取温度对油脂提取率无明显影响。因此，选取提取温度80℃为较优的提取条件用于后续实验。

2.2 九香虫油脂提取的正交实验

在单因素实验的基础上，以九香虫油脂提取率为考察指标，以液料比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)三个因素设计三因素三水平的正交实验，正交实验因素水平见表1，正交实验设计与结果见表2(每组实验进行3次重复)。

表1 正交实验因素水平

由表2可知，提取温度对九香虫油脂提取率的影响最大，各因素的影响主次顺序为提取温度>液料比>提取时间，且最佳提取条件为A2B3C2，即液料比6∶1、提取温度90℃、提取时间3 h。在最佳条件下进行4次验证实验，九香虫油脂提取率分别为45.565%、42.686%、42.960%、45.869%，平均为(44.270±1.679)%。

表2 正交实验设计与结果

实际应用中可根据需要适当调整提取条件，考虑到实际生产中温度过高可能会破坏油脂结构而影响油脂品质(有待进一步验证)，建议提取温度为75～80℃。

2.3 九香虫油脂作用下乳腺癌细胞形态学变化

九香虫油脂对小鼠乳腺癌细胞4T1与人乳腺癌细胞HCC1937形态的影响见图4。

注：A.阴性对照组；B～D.分别为0、8、16 mg/mL九香虫油脂(含1%无水乙醇)处理组。

由图4可见：与阴性对照组相比，1%无水乙醇作用24 h，对两种细胞的细胞形态及细胞密度均无明显影响，证实其作为有机溶剂溶解油脂的同时不会对细胞造成损伤；8 mg/mL九香虫油脂作用24 h，贴壁细胞数量明显减少，且部分细胞发生皱缩；16 mg/mL九香虫油脂作用24 h，细胞皱缩程度更为明显。结果说明九香虫油脂对两种乳腺癌细胞造成损伤，导致细胞贴壁能力减弱并发生皱缩。

2.4 九香虫油脂对乳腺癌细胞增殖抑制作用

不同质量浓度九香虫油脂处理对小鼠乳腺癌细胞4T1和人乳腺癌细胞HCC1937增殖的影响结果见图5。

注：Control为阴性对照组；***表示各处理组细胞增殖率与阴性对照组比较差异极显著，P<0.001。

由图5可见，与阴性对照组相比，1%无水乙醇处理24 h对两种细胞增殖率无显著影响(4T1、HCC1937细胞增殖率分别为(99.390±0.007)%、(99.910±0.025)%)，证实其作为有机溶剂溶解油脂的同时不会对细胞增殖率造成明显影响。

由图5(a)可见，与阴性对照组相比，4、8 mg/mL九香虫油脂处理小鼠乳腺癌细胞4T1 24 h，细胞增殖率(分别为(97.351±0.005)%、(95.826±0.004)%)无显著变化，而12、16 mg/mL九香虫油脂处理小鼠乳腺癌细胞4T1 24 h，细胞增殖率极显著降低(分别为(26.275±0.061)%、(2.129±0.004)%)。由图5(b)可见，与阴性对照组相比，4、8、12、16 mg/mL九香虫油脂处理人乳腺癌细胞HCC1937 24 h，细胞增殖率极显著降低(分别为(89.130±0.043)%、(89.150±0.060)%、(17.540±0.039)%、(0.500±0.001)%)。九香虫油脂作用于小鼠乳腺癌细胞4T1、人乳腺癌细胞HCC1937 24 h 的半抑制浓度(IC50)分别为10.850、10.100 mg/mL。本研究证明九香虫油脂具有良好的抗乳腺癌活性，能够改变细胞形态并显著抑制其增殖，这可能与九香虫油脂中含奇数碳脂肪酸相关[19]，有报道称昆虫油脂中含有的奇数碳脂肪酸具有特殊的生理活性，如抗癌活性等[2，20]。

3 结 论

采用索氏抽提法提取九香虫油脂，通过单因素实验和正交实验对提取九香虫油脂的工艺条件进行优化，得到最优提取条件为液料比6∶1、提取温度90℃、提取时间3 h，此条件下九香虫油脂提取率为(44.270±1.679)%。CCK-8法细胞增殖抑制实验结果表明，九香虫油脂能够显著抑制小鼠乳腺癌细胞4T1、人乳腺癌细胞HCC1937体外增殖，并能够改变细胞形态，导致细胞皱缩，细胞数量减少。