手性环氧醇及其磷酸酯化物的合成及抗肿瘤活性筛选

张 迪，陈 平，王 舒，戚仲钰，詹小燕，杜 曦

1.西南医科大学药学院 药物化学教研室（泸州 646000）；2.遂宁市中心医院 药学部（遂宁 629000）；3.天府中药城管理委员会（彭州611900）；4.西南医科大学基础医学院 化学教研室（泸州 646000）

环氧化物，尤其是手性环氧醇，是各种活性药物的重要砌块[1-6]。例如，抗肿瘤化合物FR901464[7]、depudecin[8]和抗病毒核苷[9]都属于手性环氧化物。目前，各种手性环氧醇的制备还是以Sharpless 法[10-11]为主，该法以烯丙醇为底物，Ti配合物为催化剂，可获得较高收率及对映异构过量的手性环氧醇（收率85%，ee 值90%～99%）（图1）。然而，Sharpless 法在含苯基或炔基的烯丙醇环氧化领域应用较少，从现有研究来看，大基团芳香烯丙醇的环氧化效果较小基团取代的烯丙醇差[12]。

图1 Sharpless不对称环氧化Figure 1 Sharpless asymmetric epoxidation

本研究通过对催化剂种类、催化剂-配体的摩尔比、分子筛类型、温度和时间等条件的筛选，拟建立含苯基或炔基的烯丙醇的环氧化优化反应体系，获得该类烯丙醇的环氧化产物。同时，鉴于对环氧化物的稳定性、选择性和生物利用度提高的考虑，对环氧化物分子进行修饰具有一定的必要性。文献调研发现，不少药物的磷酸酯化物均表现出不错的活性作用[13-16]，因此，磷酸酯化常作为药物设计中的重要手段[17]。由此，本研究对获得的环氧醇进行磷酸酯化修饰，并对环氧醇及其相应的磷酸酯化物进行抗肿瘤活性的评估，以期获得该类化合物的生物活性信息。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

如无特殊说明，所有溶剂经预干燥处理后使用，试剂均为分析纯。1H NMR、13C NMR 和31P NMR 用Bruker AM-400 型核磁共振仪测定（以TMS 为内标，CDCl3为溶剂）；质谱采用Finnigan LCQDECA 质谱仪测定；HPLC采用岛津LC-2030测定。

1.2 化合物3b～8b的合成与表征

将活化的4 Å 分子筛（60 mg）置于10 mL单颈圆底烧瓶，氮气置换后加入3 mL超干二氯甲烷，于-25 ℃下搅拌冷却15 min，再依次加入四异丙醇钛（29.12 μL，0.0984 mmol）和（L）-（+）-酒石酸二异丙酯（31.05 μL，0.1476 mmol），搅拌30～40 min，添加叔丁基过氧化氢（2.98 mL，2.98 mmol）并搅拌60 min，最后，逐滴加入2-戊基-3-苯基烯丙醇（0.38 g，2 mmol），搅拌4 h。待反应完成后，加入适量含30% 氢氧化钠的饱和氯化钠溶液，经减压蒸馏、柱层析分离得2-戊基-3-苯基-2，3-环氧丙醇（3b）。4b～8b的合成同上。产物的产率及对映异构过量（ee）值利用HPLC测定，产物结构采用NMR、MS进行表征。

1.3 3c～5c和8c的合成与表征

氮气保护下，于10 mL单颈圆底烧瓶中依次加入：2-戊基-3-苯基-2，3-环氧丙醇（3b）（1 mmol，0.206 g），新蒸二氯甲烷（20 mL），N，N-二甲基甲酰胺（0.1 mmol，12.2 mg），无水三乙胺（3 mmol，0.4 mL），25 ℃下搅拌30 min，再加入氯磷酸二苯酯并搅拌30 min。待反应完成后，加入适量冰水，经减压蒸馏、柱层析分离得2-戊基-3-苯基-2，3-环氧丙烷基磷酸二苯酯（3c）。4c～5c，8c合成方法同上。产物的产率及ee值利用HPLC测定，产物结构采用NMR、MS进行表征。

1.4 抗肿瘤活性初筛

取出冻存细胞于37 ℃水浴中快速溶解，加入RPMI1640 或DMEM 培养基混匀离心，弃去上清液，用培养基重悬细胞沉淀后，将重悬细胞液加入含培养基的培养瓶中，于37 ℃5%CO2孵箱中培养，待细胞长至对数生长期，将其接种于96孔板上，每孔100 μL，培养24 h。先用二甲基亚砜溶解各试验样品，配成100 mmol/L的各试验样品储备溶液，然后用相应培养基稀释成浓度梯度的待测样品，以预实验确定的大致有效浓度范围及作用时间进行药物处理，每个浓度设复孔，100 μL/孔，于37 ℃5%CO2的培养箱中培养1 d。药物处理结束后，加入含10% CCK8 的培养基100 μL，避光培养1 h，用酶标仪（检测波长450 nm）测定吸光值，计算药物的半数抑制浓度IC50值。

2 结果

2.1 手性环氧醇及其磷酸酯化物的合成与表征

2.1.1 手性环氧醇及其磷酸酯化物的合成 试剂和条件：（i）4Å MS，Ti（OiPr）4，（L）-（+）-DIPT，TBHP，DCM，-25 ℃，4 h；（ii）三氟乙醇，氯磷酸二苯酯，DMAP，r.t.，30 min（图2）。

图2 环氧化物及其磷酸酯化物的合成Figure 2 Synthesis of epoxides and their phosphate esters

按1.2及1.3所述方法合成了多个环氧醇及其磷酸酯化物，如表1所示。

表1 环氧醇及其磷酸酯化物的合成Table 1 Synthesis of epoxide alcohols and their phosphate esters

2.1.2 手性环氧醇及其磷酸酯化物的表征 2-戊基-3-苯基-2，3-环氧丙醇（3b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.43-7.24（m，5H），4.25（s，1H），4.00-3.90（m，1H），3.82（dd，J=12.4，9.1 Hz，1H），1.98（dt，J=9.4，4.7 Hz，1H），1.60-1.43（m，1H），1.41-1.00（m，8H），0.76（t，J=6.8 Hz，3H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 135.61，128.06，127.54，126.39，66.16，62.89，60.23，31.74，27.32，24.24，22.17，13.82.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C14H20NaO2]+：243.1356，found：243.1326.

2-戊基-3-苯基-2，3-环氧丙烷基磷酸二苯酯（3c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.58-7.06（m，15H），4.38（d，J=6.4 Hz，2H），4.08（s，J=22.8 Hz，1H），1.47-1.35（m，2H），1.33-1.16（m，2H），1.15-1.05（m，2H），1.04（s，2H），0.73（d，J=6.6 Hz，3H）;31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-11.75;13C NMR（CDCl3，100 MHz）：δ 150.47，134.72，129.89，128.10，127.80，126.49，125.54，120.10，70.50，63.86，61.61，31.64，26.45，24.01，22.18，13.83.HRMS（ESI）：calculated m/z[M+Na]+for[C26H29NaO5P]+：475.1645，found：475.1629.

3-苯基-2，3-环氧丙醇（4b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.42-7.27（m，5H），4.08（ddd，J=12.8，4.9，2.3 Hz，1H），3.96（d，J=2.1 Hz，1H），3.87-3.78（m，1H），3.34-3.13（m，1H），2.06（d，J=7.1 Hz，1H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 136.64，128.53，128.35，125.73，62.42，61.23，55.59.

3-苯基-2，3-环氧丙烷基磷酸二苯酯（4c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.69-7.02（m，15H），4.44（dt，J=156.7，48.0 Hz，2H），3.82（s，1 H），3.29（s，1 H）；31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-12.37；13C NMR（CDCl3，100MHz）：δ150.32，135.81，129.87，128.57，125.71，125.55，120.15，120.10，68.22，59.56，56.35.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C21H19NaO5P]+：405.0862，found：405.0838.

2-甲基-3-苯基-2，3-环氧丙醇（5b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.42-7.25（m，5H），4.25（s，1H），3.89（d，J=12.5 Hz，1H），3.78（d，J=12.5 Hz，1H），1.32（dd，J=6.2，1.6 Hz，1H），1.11（s，3H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 135.59，128.14，127.61，126.43，64.96，63.83，60.21，13.48.HRMS（ESI）：calculated m/z[M+Na]+for[C10H12NaO2]+：187.0730，found：187.0724.

2-甲基-3-苯基-2，3-环氧丙烷基磷酸二苯酯（5c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.19（dd，J=30.8，24.3 Hz，15H），4.44-4.11（m，2H），4.01（d，J=20.5 Hz，1H），1.07（d，J=19.9 Hz，3H）;31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-11.86;13C NMR（CDCl3，100 MHz）：δ 149.35，133.59，128.74，127.09，126.79，125.45，124.42，118.95，71.49，60.47，60.17，12.15.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C22H21NaO5P]+：419.1019，found：419.1004.

2，3-二苯基-2，3-环氧丙醇（6b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 8.06-6.80（m，10H），5.03（s，1H），4.16（s，1H），3.31（s，1H），2.42（s，1H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 139.06，136.45，128.70，128.48，128.40，128.31，126.55，125.71，71.08，64.92，54.86.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C15H14NaO2]+：249.0886，found：249.0854.

1-辛炔基-3-苯基-2，3-环氧丙醇（7b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.49-7.29（m，4H），4.74（td，J=4.8，2.1 Hz，1H），4.07（d，J=2.0 Hz，1H），3.33（dd，J=2.8，2.2 Hz，1H），2.25（td，J=7.1，2.0 Hz，2H），2.14（d，J=4.9 Hz，1H），1.61-1.56（m，2H），1.46-1.07（m，6H），1.00-0.80（m，3H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 136.24，131.50，128.82，128.58，127.99，127.81，126.77，87.61，79.09，78.91，63.22，31.33，28.59，28.56，22.55，18.82，14.06.HRMS（ESI）：calculated m/z [M +Na]+for[C17H22NaO2]+：281.1512，found：281.1096.

4-炔基-2，3-环氧丁醇（8b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 3.98（s，1H），3.75（s，1H），3.57-3.14（m，3H），2.43-2.33（m，1H），1.87（d，J=46.3 Hz，2H），1.33（d，J=3.8 Hz，1H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 79.62，72.64，59.94，59.74，42.16，21.77.GC-MS（EI）m/z（%）：31.93（40），27.94（100），18.95（55），17.94（60）.

4-炔基-2，3-环氧丁烷基磷酸二苯酯（8c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.21（dd，J=50.1，64.0 Hz，10H），4.34-4.15（m，2H），3.35（s，1 H），3.26（s，1 H），2.28（s，1 H）;31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-11.75;13C NMR（CDCl3，100 MHz）：δ 148.91，128.66，124.67，119.02，77.84，71.89，65.87，55.63，41.70.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C17H15NaO5P]+：353.0549，found：353.0526.

2.2 抗肿瘤活性初筛

上述化合物通过CCK8 细胞增殖实验进行了抗肿瘤活性初筛，结果见表2。

表2 环氧醇及其磷酸酯化物的抗肿瘤活性初筛Table 2 Preliminary screening of antitumor activity of epoxide alcohols and their phosphate esters

3 讨论

3.1 手性环氧醇及其磷酸酯化物的合成

如图2所示，以3a为模型底物进行环氧化反应，考察 了Ti（OiPr）4-（L）-（+）-DIPT 和Ti（OiPr）4-（L）-（+）-DET 对反应的催化作用，发现Ti（OiPr）4-（L）-（+）-DIPT 的催化效果较好，当n（Ti（OiPr）4）：n（（L）-（+）-DIPT）=0.65 时产物3b 的ee 值可达92%。结果表明，不同配体及不同的配比对Ti 配合物的催化效果具有较显著的影响。综合环境因素及经济因素，以n（Ti（OiPr）4）：n（（L）-（+）-DIPT）=0.65作为优化条件。

从实验结果上不难发现，4 Å和3 Å均能提高ee 值（ee ＞90%），但前者的产率远优于后者，我们猜测可能是由于4Å分子筛的空隙相较于其他分子筛对反应体系生成的微量水有更好的吸附能力，能使因水存在而失活的催化剂再次“活化”，使催化剂保持催化活性[18-20]。此外，在-15 ℃至-35 ℃范围内，ee 值无明显差异，但产率先增加后递减，在-25 ℃达到最大值。在优化条件下，反应时间由8 h缩短到4 h，以保证最佳产率和ee值。

基于不同基团的活性差异以及调整溶解性的考虑，对第一步得到的环氧化合物进行了磷酸酯化反应。以2-戊基-3-苯基烯丙醇的环氧化产物3b为模型反应物，进行磷酸酯化反应，得到环氧磷酸酯化物3c。其他化合物的合成参照以上方法进行。结果表明，磷酸酯化反应迅速且彻底，产物的产率高（均大于96%），而ee值依赖于磷酸酯化反应底物环氧醇的ee值。

3.2 抗肿瘤活性初筛

在给定浓度范围（100～800 μmol/L）内，8c 对Hela细胞、231 细胞和HepG2 细胞增殖均有良好的抑制作用，且其对三种细胞的抑制强弱依次为Hela、HepG2、231。而3b、3c 则仅对Hela 细胞增殖有一定的抑制活性，4c仅对HepG2细胞增殖有一定的抑制作用。

4 结论

本文研究了以烯丙醇为起始原料的Sharpless不对称环氧化反应以及环氧醇磷酸酯化反应。优化的反应条件适用于含苯基或炔基的烯丙醇类化合物，有较高产率和ee值。对合成的环氧醇及其相应的磷酸酯化物进行抗肿瘤活性初筛，其中部分化合物对肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用。

（利益冲突：无）