烟草黑胫病拮抗菌的筛选鉴定与防病促生作用研究

王亚月，贾方方，李俊营，许跃奇，阎海涛，何晓冰，刘冬梅，常 栋*

烟草黑胫病拮抗菌的筛选鉴定与防病促生作用研究

王亚月1，贾方方1，李俊营2，许跃奇2，阎海涛2，何晓冰2，刘冬梅1，常 栋2*

（1.商丘师范学院生物与食品学院，植物与微生物互作河南省高校重点实验室，河南 商丘 476000；2.河南省烟草公司平顶山市公司，河南 平顶山 467000）

为获取优良黑胫病生防菌株，从大连海域生长的海绵中分离到一株具有高拮抗活性的放线菌DL157，根据培养和显微形态、生理生化数据及16S rRNA序列分析，鉴定DL157菌株为浅紫链霉菌（）。菌株DL157在平板对峙、盆栽试验与大田试验中均表现出较高的抑菌活性，抑制率分别为60.28%、69.2%和83.5%。DL157菌株可以通过分泌蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶破坏烟草疫霉菌菌丝细胞壁结构，致使其细胞壁受损，原生质渗漏，进而表现出抑制作用。DL157菌株可以促进烟草种子萌发和幼根伸长，提高萌发烟草种子可溶性蛋白含量与淀粉酶活性。此外，DL157菌株具有遗传稳定性，经过50次传代培养，依然保持较高抑菌活性。综上，浅紫链霉菌DL157具有开发为烟草黑胫病生防制剂的潜力。

烟草黑胫病；浅紫链霉菌；生防；促生

烟草黑胫病（Tobacco black shack）是威胁烟草产量与质量的一种严重的土传性真菌病害，其病原菌为烟草疫霉菌（var.），该病极易在高温、高湿环境下流行爆发，典型症状为植株矮化，叶片自下而上凋萎发黄，根部和茎部萎缩、坏死，茎髓部呈碟片状[1]。在某些病害严重的地块，其发病率高达75%以上，造成生产上大量减产，甚至绝收，给我国烟草产业带来重大威胁[1-2]。

生产上，烟草黑胫病的防治包括农业防治、化学防治与生物防治措施。农业防治通常采取间套作、轮作方式或者使用抗病品种。然而，其他种类植物的引入可能会降低烟叶品质[3-5]，如大豆与茼蒿的引入虽然可提高烟叶中总氮和烟碱的含量，却降低了总糖含量[3]。抗烟草黑胫病种质性状是由多基因控制，其转育难度极大，且多为中抗或耐病品种，高抗品种甚少。化学防治通常使用化学药剂如甲霜灵、氟吡菌胺、霜霉威盐酸盐、烯酰吗啉以及丁吡吗啉等[6-9]，然而长时间大面积重复施用同一种药剂，容易使病原菌产生抗药性，防治效果逐渐降低，同时也会造成环境污染及农药在烟叶中的残留。生物防治通过微生物产生抗生素等抗菌物质来抑制病原菌的生长，无毒害、无残留、对环境友好，有利于维护生态平衡，保护物种多样性，促进绿色生态烟草农业发展，在烟草病害防治中备受关注[1,10-11]。

烟草黑胫病的发生与根际土壤微生物有着紧密联系，土壤中有益菌群数量的降低以及有害菌群数量的增加都会增加病害发生率。微生物菌剂可以提高土壤酶活性、改变土壤微生物菌群、改良土壤养分环境，从而调控土壤微生物群，改变其功能多样性，进而抑制作物病虫害[12-13]。目前已开发的微生物菌剂生防菌多分离自陆生环境，因此导致其在盐含量高的土壤中较难存活和发挥生物防治功能。海洋环境由于其压强高、含盐量高、营养成分少、温度低等特点，使得生活在其中的放线菌的生理生化特征和代谢途径与陆生放线菌有所差异，是新型农用抗生素的重要来源，在农业生产中开发前景广阔[14-15]。

本研究以烟草黑胫病的生物防治为主要目标，从大连海域生长的海绵中分离筛选获得1株对烟草黑胫病防治效果较高的拮抗菌，通过微观形态、生理生化特性、16S rRNA基因序列分析对其进行分类鉴定，研究该菌株对烟草黑胫病的防治效果，以期为烟草黑胫病的生物防治提供优良的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 拮抗菌种与病原菌的获得 拮抗菌DL157菌株从大连海域新鲜海绵中分离获得，纯化后菌株于20%甘油中保存，−80 ℃保藏备用。烟草黑胫病病原菌分离于河南省平顶山市烟田的黑胫病患病烟株，保存于河南省植物与微生物互作平台高校重点实验室[16]。

1.1.2 培养基与主要试剂 ISP2培养基：麦芽浸粉10 g，酵母粉4 g，葡萄糖4 g，加去离子水至1 L，调pH至7.2。胡萝卜固体培养基：胡萝卜200 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加去离子水至1 L，自然pH。PDA培养基：200 g马铃薯，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加去离子水至1 L，调pH至7.2。无机盐淀粉培养基：可溶性淀粉10 g，(NH4)2SO42 g，CaCO33 g，MgSO4∙7H2O 1 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，琼脂20 g，加去离子水至1 L，调pH至7.2。燕麦琼脂培养基：燕麦片20 g，微盐溶液1 mL，琼脂20 g，加去离子水至1 L，调pH至7.2。查氏培养基：蔗糖30 g，FeSO4∙7H2O0.01 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4∙7H2O 0.05 g，KCl 0.5 g，琼脂20 g, 加去离子水至1 L，调pH至7.2。营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，加去离子水至1 L，调pH至7.2。全脂牛奶培养基：葡萄糖4 g，琼脂 2 g，加去离子水95 mL，灭菌后降至60 ℃时，加入5 mL无菌全脂牛奶，混合并调节pH至5.6。

1.2 拮抗活性测定

1.2.1 室内平板对峙试验 采用平板对峙法测定DL157菌株对烟草黑胫病的抑菌活性。将烟草黑胫病病原菌在胡萝卜培养基平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块（半径5 mm），接种到胡萝卜培养基平板中央，在菌块4周离中心25 mm处对称接种3 μL拮抗菌液（约1.0×108cfu/mL），倒置，每个处理重复3次，5 d后观察抑菌结果，并测量其抑菌半径，计算抑菌率[17]。

1.2.2 盆栽防效试验 将DL157菌株接种于ISP2液体培养基中，于28 ℃、140 r/min振荡培养5 d，稀释制成拮抗菌液（孢子浓度约1.0×108cfu/mL），采用灌根法每盆接种200 mL拮抗菌液，7 d后接种烟草黑胫病病原菌200 mL（孢子浓度约为1.0×108cfu/mL），此后每7 d接种拮抗菌液1次，共接种3次；对照组CK用清水处理，对照组CK1使用58%甲霜·代锰锌可湿性粉剂600倍每株200 mL处理；对照组CK2以旺泰宝微生物菌剂（有效成分为哈茨木霉菌与棘孢木霉菌，菌含量≥2亿/g）可湿性粉剂600倍每株200 mL处理；对照组CK3以碧苗复合微生物菌肥（有效成分为高活性微生物菌、次生代谢物及腐植酸）进行处理。每处理8株，各处理重复3次，接种14 d后开始调查发病情况。烟草黑胫病分级参照中华人民共和国烟草行业标准（GB/T 23222—2008）进行[17]。

1.2.3 大田防效试验 大田防效试验在平顶山市白龙庙村进行，该烟区自2018年来黑胫病频繁发生，且为主要病害。烟株于2021年5月1日移栽，20 d后接种拮抗菌液孢子浓度约1.0×108cfu/mL，每株灌根200 mL，对照组CK、CK1、CK2与CK3设置同1.2.2。由于大田烟株生育期比盆栽烟株长，故将大田接种时间间隔定为15 d，共灌根3次。每处理50株，共重复3次。接种14 d后开始调查发病情况。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 生理生化特征 参照《放线菌系统分类技术》[18]进行生理生化指标测定。

1.3.2 16S rRNA鉴定 使用takara基因组提取试剂盒提取DL157基因组DNA，以16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和R1492（5'-CGGC-TACCTTGTT ACGAC-3'）进行PCR。反应体系50 μL：PremixTap酶25 μL、模板1 μL、引物27f 1 μL、引物1492r 1 μL、重蒸水22 μL。PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物经纯化后送天津金唯智测序。将测得序列在NCBI Genbank在线Blast，下载具有登录号的相关同源序列，借助于MEGA5软件以邻位法构建系统进化树。

1.4 DL157菌株抑菌机理初步研究

1.4.1 DL157菌株对病原菌菌丝形态的影晌 分别挑取在正常培养基上和平板对峙试验中培养3 d的烟草疫霉菌边缘菌丝于无菌离心管中，PBS缓冲液（pH 7.2，0.1 mol/L）冲洗，离心收集菌丝，用2.5%丙二醛固定2 h，PBS缓冲液洗涤3次后，依次用10%、30%、50%、75%、85%、90%与100%的乙醇分别脱水15 min，锇酸熏3 ｈ，置于铜网喷金，于扫描电镜下观察[19]。

1.4.2 DL157菌株拮抗活性因子检测 将DL157菌株接种于ISP2液体培养基中，于28 ℃、140 r/min振荡培养5 d，12000 r/min，4 ℃离心10 min，获得发酵液上清；离心沉淀用50 mmol/L KH2PO4- K2HPO4缓冲液（pH 7.5）重悬，置于冰浴中超声，条件为300 W，工作5 s，间隙5 s，120个循环。12000 r/min离心30 min，收集上清，获得细胞粗提物。

参照宁爽[20]蛋白酶活性测定方法，运用全脂牛奶平板法检测DL157菌株发酵液上清与细胞粗提物蛋白酶活性：在全脂牛奶平板中央打孔，每孔分别各自加入20 μL发酵液上清与细胞粗提物，密封，25 ℃静置7 d，加入10%三氯乙酸固定2 h后，运用考马斯亮蓝G-250染色过夜，乙醇-冰乙酸脱色，通过计算菌落直径与透明圈直径的比值，定性比较发酵液上清与细胞破碎液蛋白酶活性高低，比值越低，蛋白酶活性越高。几丁质酶与纤维素酶活性分别运用试维素酶活性检测试剂盒（上海原鑫生物，YX-SH-TQ22025）与几丁质酶活性检测试剂盒（上海原鑫生物，YX-W-B917）进行检测。

1.5 DL157菌株对烟草生长的影响

1.5.1 DL157菌株对烟草种子萌发的影响 分别用DL157菌株培养液原液、10倍稀释液与100倍稀释液浸泡烟草种子24 h，于无菌培养皿中，25 ℃恒温培养箱内培养，第3天开始每隔12 h记录一次发芽数（以根长等于种子的长或者芽长等于种子长的1/2为发芽标准)），记录到第6天结束。芽发齐后，转移到光照培养箱培养，3 d后测量根长，根长为从根基部到最长根尖端的长度。以无菌水处理为对照，每处理50粒种子，3个重复。

1.5.2 DL157菌株对种子萌发时可溶性蛋白含量和总淀粉酶活性的影响 分别用DL157菌株培养液原液、10倍稀释液与100倍稀释液浸泡烟草种子24 h后，将种子置于无菌培养皿中，对照烟草种子采用无菌水处理，3个重复。25 ℃恒温培养箱静置，于发芽后第9天取0.5 g发芽种子，加入5 mL磷酸缓冲液（pH 6.9），充分磨匀，静止30 min后，将匀浆液转移至离心管，4 ℃、12000 r/min离心10 min，收集所有上清，备用。可溶性蛋白含量运用考马斯亮蓝法检测，磷酸缓冲液作为空白处理[22]。淀粉酶活性运用3，5-二硝基水杨酸法测定，磷酸缓冲液作为空白处理[21]。

1.6 DL157菌株传代的抑菌稳定性研究

拮抗菌株于ISP2培养基上传代培养，每48 h转接１次，连续传代50次，每个处理3个平行。平板对峙试验测定初代菌株与传代菌株对烟草疫霉菌的抑菌效果，根据抑菌带宽度变化分析传代对拮抗菌抑菌效果的影响。

2 结 果

2.1 烟草疫霉病拮抗菌株的筛选与抑菌作用

2.1.1 平板对峙试验抑菌效果 从大连海域海绵中分离获得的6株拮抗菌，对烟草疫霉菌病原菌的抑制率达20%～60%。其中，菌株DL157拮抗效果最高，该菌株对烟草黑胫病的抑菌直径达（48.22± 0.83）mm，抑制率达（60.28±1.04）%（图1）。

2.1.2 盆栽与大田防效 在盆栽试验中，与对照CK相比，化学药剂甲霜锰锌、生防菌肥碧苗和生防菌剂旺泰宝与DL157菌液处理的烟株发病率分别降低28.2、27.4、10.4、48.4百分点，病情指数分别降低24、2.5、4.1、39.6；且经DL157处理后的烟株发病率和病情指数均低于甲霜锰锌、碧苗和旺泰宝。DL157防效分别是甲霜锰锌、碧苗与旺泰宝的1.6、15.7与9.6倍（表1）。

在大田中，与CK相比，甲霜锰锌、碧苗、旺泰宝与DL157菌液处理的烟株发病率和病情指数均降低，发病率分别降低4.7、4.8、5.4、8.6百分点，病情指数分别降低2.2、3.2、3.3、5.6；且经DL157处理后的烟株发病率和病情指数均低于甲霜锰锌、碧苗和旺泰宝。DL157防效分别是甲霜锰锌、碧苗与旺泰宝的2.5、1.8和1.7倍（表1）。

2.2 菌株DL157的鉴定

2.2.1 形态特征 菌株DL157菌落为圆形，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，白色粗糙不透明，菌落中央凹状突起，气生菌丝发达（图2）。显微镜下观察，菌丝长直，孢子呈卵圆与椭圆形（图3）。

图1 DL157菌株对烟草疫霉菌的拮抗效果

表1 DL157菌株盆栽和大田防效

注：表中每列数据后不同字母代表差异显著（≤0.05），下同。

Note: value within each column of the same cultivar not marked by the same lowercase letters signifies significant difference (≤0.05), the following tables are the same.

图2 DL157菌株菌落形态

图3 DL157菌株显微镜观察图

2.2.2 培养特征 表2为菌株DL157在查氏琼脂培养基、无机盐淀粉培养基、酵母膏麦芽汁培养基、燕麦琼脂培养基、PDA培养基、营养琼脂培养基上的生长特征。在不同培养基中，气生菌丝与基内菌丝生长状态不同，产生的可溶性色素亦不同。

表2 菌株DL157在不同培养基上的培养特征

2.2.3 生理生化特征 如表3所示，菌株DL157能够利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖等碳源，但不能利用羧甲基纤维素钠。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》与《放线菌的分类和鉴定》，结合DL157在不同培养基上的形态与显微镜下观察的结果，初步确定DL157菌株为链霉菌（）。

2.2.4 分子鉴定 将测得的序列经blast比对，下载具有登录号的相关同源序列，借助于MEGA5软件以邻位法构建系统进化树（图4），结果表明该菌株与EGI125菌株同聚一支，且同源性达99%，进一步确定DL157菌株为浅紫链霉菌（）。

表3 菌株DL157生理生化特征

注：“+”阳性；“–”阴性。

Note: “+”, positive; “–“, negative.

图4 DL157菌株16S rRNA基因序列系统发育树

2.3 DL157菌株抑菌机理

2.3.1 DL157菌株对病原菌菌丝形态的影响 如图5所示，经扫描电镜观察，正常生长的烟草疫霉菌丝形态饱满，细胞壁光滑，胞质均匀透明，分枝正常（图5A和5B），而平板对峙培养中受抑制菌落边缘的菌丝形态与对照相比发生很大的变化，菌丝出现缠绕，扭曲集结，不正常分枝增多，皱缩（图5C和5D），部分菌丝细胞壁不完整（图5E），原生质渗漏，菌丝细胞畸形生长（图5F），说明DL157菌株或其分泌物对病原菌菌丝的生长产生了不利影响。

注：A（×1000）与B（×5000）为正常菌丝；C（×2000）与D（×10000）为受抑制菌丝扭曲集结形态；E为受抑制菌丝细胞壁裂解状态（×5000）；F为受抑制菌丝畸形生长（×10000）。

2.3.2 DL157菌株拮抗活性因子 在DL157菌株发酵液上清与细胞粗提物中均检测出蛋白酶、几丁质酶与纤维素酶活性，且发酵液上清酶活性均高于细胞粗提物，分别是其8、1.7和1.1倍（表4）。

2.4 DL157菌株对烟草生长的影响

2.4.1 DL157菌株对烟草种子萌发的影响 烟草种子经水和DL157菌株发酵原液、10倍稀释液与100倍稀释液浸种处理后，随着时间的延长，发芽率均呈现递增趋势，其中第3天发芽率最高（图6）。与水浸种处理（CK）相比，烟草种子经DL157菌液浸种处理后发芽率均有所提高，其中经原液处理的烟草种子发芽率最高，第1、2、3天发芽率分别为66.7%、74.7%与85.3%，与CK相比分别提高1.3、1.3和1.4倍。如图7所示，烟草种子经DL157菌株发酵原液、10倍稀释液与100倍稀释液浸种处理后，根长分别为0.80、0.77和0.65 cm，与对照组相比分别提高2.1、2.0和1.7倍。综上可知，DL157不同浓度培养液浸种处理对烟草种子萌发和幼根的伸长有一定的促进作用。

表4 拮抗因子活性

注：37 ℃条件下，每小时催化底物产生1 mg产物所需要的酶量定义为为1个活力单位U。

Note: At 37 ℃, the amount of enzyme required to produce 1 mg of product from the catalytic substrate per hour is defined as 1 U.

注：图中不同字母代表不同处理间差异显著（p≤0.05），下同。

图7 DL157菌株对烟草种子萌发根长的影响

2.4.2 DL157菌株对种子萌发时可溶性蛋白含量和总淀粉酶活性的影响 如图8所示，烟草种子经DL157菌株发酵原液、10倍稀释液与100倍稀释液浸种处理后，其幼苗可溶性蛋白含量分别为18.3、10.0和7.6 mg/g，与CK相比，原液与10倍稀释液分别提高2.5与1.4倍，而100倍稀释液处理与对照相当。表明DL157发酵液浓度较高时可以提高萌发烟草种子可溶性蛋白含量，浓度较低时不能提高。

图8 DL157菌株萌发烟草种子可溶性蛋白含量的影响

烟草种子经DL157培养液浸种处理后，其淀粉酶活性变化不一。与对照组水浸种处理相比，原液处理后淀粉酶活性降低10%，10倍稀释液与100倍稀释液处理后淀粉酶活性分别提高1.1倍与1.4倍（图9）。

注：25 ℃条件下，每分钟催化底物产生1 μmol产物所需要的酶量定义为1个活力单位U。

2.5 DL157菌株传代稳定性

拮抗菌株DL157经过50次传代，抑菌率与第1代抑菌率相当（表5），表明经过多次传代，菌种依然没有退化，传代次数并不影响拮抗菌株的抑菌稳定性。

表5 DL157菌株传代稳定性

3 讨 论

生物防治中，放线菌是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，是抗生素的重要来源，由于其对生态环境影响小、污染少等特点，在植物病害防控中，应用较普遍，尤其是链霉菌属。如从烟草根际土壤分离的鲁萨链霉菌（）YY75菌株、高贵链霉菌（）YY124菌株、娄彻链霉菌（）LN204菌株、珊瑚链霉菌（）SX92菌株、金黄垂直链霉菌（）SX59菌株、波卓链霉菌（）F-7菌株、金黄垂直链霉菌（）SA74菌株与黄麻链霉菌（）AUH-1菌株在平板对峙试验中对烟草疫霉菌的抑菌率都高于70%[22-25]；不产色链霉菌（）F8菌株对烟草黑胫病的盆栽防效达70.3%[26]，郝氏链霉菌（）MT35菌株的田间试验防治效果高达75.3%[27]。放线菌种类多样，分布于土壤、污水、海洋等生态环境中，不同生境来源的放线菌代谢功能各异。目前分离的用于烟草黑胫病防治的放线菌多从土壤中分离，且很多放线菌仅限于室内平板研究，仅有少数利用盆栽与大田试验验证。相比于陆生微生物，海洋恶劣的化学和物理条件更有利于生活在其中的微生物产生大量新分子，这些分子在多样性、结构和功能特征方面表现出优良特性，是农用新型先导化合物的重要来源[28-29]。本文中DL157菌株分离自海洋环境，在田间试验中防效高达83.5%，高于目前陆生来源放线菌的防治效果。DL157菌株可以通过分泌蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶破坏烟草疫霉菌菌丝细胞壁结构，致使细胞壁受损，原生质渗漏，进而表现出抑制作用，这与在不产色链霉菌（）F8菌株中观察到的现象一致[26]，然而DL157菌株是否产生其他抑菌活性物质仍需进一步研究。

4 结 论

本研究中分离的浅紫链霉菌DL157菌株对烟草黑胫病表现出较高防效，该菌株可以分泌蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶而影响烟草疫霉菌菌丝的生长。此外，DL157菌株可以促进烟草种子的萌发和幼根的伸长，提高萌发烟草种子中可溶性蛋白含量与淀粉酶活性，具有遗传稳定性，为烟草黑胫病的生物防治提供优良的菌种资源。

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Screening, Identification of a Bacterial Strain against Tobacco Black Shank and Its Growth-promoting Effects

WANG Yayue1, JIA Fangfang1, LI Junying2, XU Yueqi2, YAN Haitao2, HE Xiaobing2, LIU Dongmei1, CHANG Dong2*

(1. Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions, Department of Biology and Food Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu, Henan 476000, China; 2. Pingdingshan Tobacco Company of Henan Tobacco Monopoly Bureau, Pingdingshan, Henan 467000, China)

To acquire excellent bacterial strains against tobacco black shack (TBS) disease, an actinobacteria DL157 with high antagonistic activity was isolated from marine sponge. Strain DL157 was identified asby morphologic observation, physiological and biochemical characterization and 16S rRNA sequence analysis. High relative control efficiency was observed in plate test, pot test and field test, with the inhibition rates being 60.28%, 69.2% and 83.5%, respectively. The hyphae cell wall structure ofwere destroyed by strain DL157 through secreting protease, cellulase and pectinase, causing cell wall damage and protoplasm leakage. Therefore, the growth ofwas inhibited. The seed germination and root growth of tobacco were promoted by strain DL157. And the soluble protein content and amylase activity of germinated tobacco seeds were increased. Moreover, genetic stability was observed in strain DL157 which still maintained high antagonistic activities after 50 passages. In summary,DL157 has the potential to be applied as antimicrobial agents against TBS disease.

tobacco black shack disease;; biological control; growth promoting

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.009

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0060-08

河南省烟草公司平顶山市公司科技项目（PYKJ202101）；河南省青年人才托举工程资助项目（2020HYTP024）；国家级青年人才托举工程资助项目（2017QNRC001）

王亚月（1990-），女，讲师，博士，主要从事农作物病害的生物防治、环境中有毒污染物的生物降解以及酶构效关系与酶分子进化研究。E-mail：wangyayue@sqnu.edu.cn。

，E-mail：cd411@outlook.com

2022-03-20

2022-08-16