生物炭菌剂对烟草黑胫病及土壤微生物的影响

贾海江，冯俊喜，吴 涛，张 鑫，孙 瞳，胡希好，王 鹏，李 振，程亚东，程昌新，李贵忠，曾祥难*，周肇峰*

生物炭菌剂对烟草黑胫病及土壤微生物的影响

贾海江1，冯俊喜2，吴 涛3，张 鑫4，孙 瞳2，胡希好5，王 鹏5，李 振4，程亚东4，程昌新3，李贵忠3，曾祥难1*，周肇峰1*

（1.广西中烟工业有限责任公司，南宁 530001；2.山东中烟工业有限责任公司，济南 250014；3.云南中烟工业有限责任公司，昆明 650231；4.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；5.山东青岛烟草有限公司，青岛 266000）

为研究生物炭菌剂对烟草黑胫病的防控效果并揭示其联合生防机制，以生物炭为载体负载解淀粉芽孢杆菌CAS02制备生物炭菌剂，并对其负载效果进行评价；采用室内盆栽试验，以易感品种“小黄金1025”为试验材料，研究不同处理生物炭菌剂对烟草黑胫病的防控效果，并从土壤化学性质、微生物群落结构组成的角度解析相关作用机理。结果表明：（1）生物炭可以有效负载生防菌CAS02，负载量为25.31×108CFU/g；（2）单独施用生防菌CAS02对烟草黑胫病的防控效果，在施药25 d后下降至2.08%，而生物炭菌剂对烟草黑胫病防控高效且持久，在第25天时仍可维持43.75%的相对防效；（3）施用生物炭菌剂显著改变了根际土壤化学性质，BC-CAS02处理的根际土壤速效磷含量较CK提高了49.58%，而速效钾含量降低了17.39%；（4）通过对比各处理16 S V3-V4区域扩增子序列可知，生物炭菌剂显著改变了土壤微生物区系结构，属水平上WCHB1-32、和等抑制植物病害的有益细菌相对丰度显著增加。综上所述，生物炭菌剂可通过改善根际土壤化学性质和微生物群落结构组成，有效提高烟草黑胫病的防控效果。

生物炭；生防菌；烟草黑胫病；土壤微生物

烟草黑胫病（Tobacco Black Shank）又称烟草疫病，是由烟草疫霉（）引起的一种毁灭性土传病害[1-2]。目前生产上防治烟草黑胫病主要以甲霜灵等化学药剂为主，但化学农药的长期使用易导致病原菌产生抗药性、烟叶农药残留量过高和环境污染等一系列问题[3-4]。生防菌的开发应用为防控烟草土传病害提供了新的手段，一些生防菌在控制植物病害方面的有效性得到了认可[5-6]。然而生产上推广的生防菌产品存在菌种单一，生防菌施入土壤后定殖和存活能力不高，生防效率低和抗病谱狭窄等问题，极大地限制了生防菌的实际推广和应用[7]。生物炭是生物质在有限的氧气下高温热解、炭化而成的一种稳定、高芳香的固体材料[8]，由于其独特的多孔结构和较大的比表面积，不仅可以改善土壤结构，还可以为生防菌提供养分和生存环境，增强生防菌在土壤环境中的存活能力，是一种很有开发前景的载体材料[9]。CHUAPHASUK等[10]研究发现，将生防菌负载到生物炭中可以提高生防菌对环境胁迫的抗性，并保护生防菌免受其他土壤微生物的侵害；ELHADIDY等[11]证实了以生物炭为接种载体制备的固定化菌剂，可显著提高番茄枯萎病的防治效果。由此可见，开发利用生物炭作为接种载体，对防治烟草土传病害具有重要意义，但目前相关研究甚少。

本试验以花生壳为原料，制备生物炭并表征其性质，然后将生物炭作为生防菌CAS02的接种载体制备生物炭菌剂。研究了生物炭菌剂对烟草黑胫病的防治效果，并从土壤化学性质及土壤微生物的角度揭示了生物炭菌剂的作用机理，为生物炭菌剂制备和烟草黑胫病绿色防治提供了理论指导和技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料及制备

供试生防菌株为解淀粉芽孢杆菌CAS02（），病原菌为烟草疫霉JM01（），烟草品种为烟草黑胫病易感品种小黄金1025，均由中国农业科学院烟草研究所提供。燕麦培养基（OA）用于烟草疫霉培养，NA培养基、NB培养基用于生防菌CAS02培养。

生物炭的制备：根据文献[12]的方法，以花生壳为原料，采用限氧升温法在500 ℃下热裂解4 h制备生物炭，并研磨过筛（2 mm）。制备的花生壳生物炭pH为9.90，呈碱性，最大持水量为72.3%，全氮、速效磷、速效钾、全碳和全氢含量分别为0.96%、33.58 mg/kg、7.71 mg/kg、16.06%和0.84%。通过扫描电镜观察生物炭形貌特征[13-14]。

生物炭菌剂的制备：将2 g（称准至0.0001 g）生物炭与25 mL CAS02重悬菌液（600值为0.4）于摇床中（28 ℃，175 r/min）混合振荡吸附24 h；通过吸附试验法[14]和扫描电镜观察[15]评价生物炭对CAS02菌株的负载效果。

1.2 生物炭菌剂防治烟草黑胫病盆栽试验

根据王耀晨等[15]的方法制备菌谷，并与取自中国农业科学院烟草研究所即墨基地大田的土壤按照菌谷∶土壤的质量比1∶100混合；挑选株高2 cm、叶片数量为5的烟苗，移栽至装有200 g土壤的花盆（上直径10 cm、高11 cm）中，设置CK（添加病原菌，每株2 g菌谷根部接种）、BC（添加病原菌+2 g生物炭）、CAS02（添加病原菌+25 mL600值为0.4的生防菌CAS02悬浮液灌根处理）和BC-CAS02（添加病原菌+2 g生物炭菌剂）4个处理，每个处理种植15株烟苗，设置3个重复。于移栽后第10天和第25天根据《烟草病害分级及调查方法》（GB/T 23222—2008）调查各处理烟株的黑胫病病情指数，并于第25天测量烟株的株高、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积、节距和叶片数。

1.3 土壤样品采集及测定

移栽后第25天采集不同处理烟株根际土[16]。其中一部分根际土置于−80 ℃超低温冰箱，用于测定土壤微生物；一部分自然风干后过0.25 mm筛，用于测定土壤样品化学性质[17]。

1.4 高通量测序分析微生物群落

采用DNeasy® PowerSoil® Kit（100）试剂盒提取土壤DNA，随后进行PCR扩增及产物检测[15]。由上海美吉生物医药科技有限公司构建高通量测序文库并完成基于Illumina MiSeq平台的测序[17]。

1.5 数据处理与统计分析

运用FLASH软件对Reads进行拼接，使用Uparse软件在相似性为97%的水平下对优质序列进行OTU聚类。对比silva数据库（细菌）并对OTUs序列进行物种注释及丰度分析。采用SPSS 26.0软件进行差异显著性检验（Duncans新复极差法，=0.05），并采用Adobe illustrator软件绘图。

2 结 果

2.1 生物炭及菌剂的表征分析

由图1A可见，花生壳炭化过程完好地保留了原生物质的细微孔隙结构，增强了生物炭的吸附能力；扫描电子显微镜对生物炭负载CAS02的定性评价结果如图1B，可以清晰地看出CAS02负载于生物炭的孔隙结构中，且生物炭菌剂的负载量为25.31×108CFU/g，生物炭较好地发挥了载体的作用。

2.2 生物炭菌剂对烟草黑胫病的防治效果

由表1可知，处理后第10天BC-CAS02处理对烟草黑胫病的相对防效为37.84%，显著高于BC处理，但与CAS02处理无显著差异；而处理后第25天CAS02处理对烟草黑胫病的相对防效下降至2.08%，BC-CAS02处理对烟草黑胫病的相对防效为43.75%，显著高于其他处理。由此可见，生物炭菌剂对烟草黑胫病的防治效果，比单独施用CAS02更为长效。

2.3 生物炭菌剂对烟草生长的调控作用

生物炭菌剂对烟株生长发育的影响如表2所示，处理后第25天，BC-CAS02处理最大叶长及最大叶面积显著高于其他处理，分别较CK提高22.27%和25.20%，最大叶宽显著高于CAS02及BC处理，但与CK无显著差异，这表明生物炭菌剂对烟株具有一定促进生长作用。

注：图A（a）、(b)、（c）为生物炭负载CAS02前扫描电镜形貌；图B（a）、(b)、（c）为生物炭负载CAS02后扫描电镜形貌。

表1 盆栽防病试验结果

注：表中同列数据后不同小写字母表示处理间差异有统计学意义（≤0.05），下同。

Note: the different lowercase letters of the same column represent statistically significance (≤0.05). The same as below.

2.4 生物炭菌剂对烟株根际土壤化学性质的影响

生物炭菌剂对烟株根际土壤的化学性质造成了一定的影响（表3）。BC-CAS02处理的土壤pH显著高于CK，铵态氮含量显著低于CK和CAS02处理而高于BC处理，速效磷含量显著高于其他处理且较CK、BC和CAS02处理分别提高49.58%、39.27%和36.61%，而速效钾含量显著低于其他处理，较CK降低了17.39%。各处理硝态氮和有机质含量均无显著差异。

2.5 生物炭菌剂对根际土壤微生物的影响

2.5.1 生物炭菌剂对根际土壤微生物结构的影响本研究采用Bray-Curtis距离矩阵主坐标分析（PCoA）比较了不同处理条件下根际土壤细菌群落属水平的变化（图2a），BC、CAS02和BC-CAS02处理的聚类结果明显远离CK，且BC和BC-CAS02处理的土壤细菌群落组成较CK差别更大。进一步分析发现，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）解释度分别为35.01%和17.33%，两个主成分方差贡献率累计为52.34%。Venn图显示，4个处理共有903个共同属，CAS02、BC和BC-CAS02处理中分别有35、17和43个特有属（图2b）。

2.5.2 生物炭菌剂对根际土壤微生物组成的影响属水平上，不同处理根际土壤细菌前十位组成及相对丰度如图3所示，鞘氨醇单胞菌属（）、灰杆菌属（）和WCHB1-32为各处理根际土壤优势菌群。与CK相比，相对丰度在CAS02、BC和BC-CAS02处理中均显著升高（＜0.05，下同），且在BC-CAS02处理中相对丰度最高；WCHB1-32相对丰度在BC-CAS02和CAS02处理中较高。

如图4所示，不同试验处理间根际土壤细菌群落组成有所差异。CAS02处理，3个细菌属显著高于CK（＜0.05，下同），BC处理，7个细菌属显著高于CK，而BC-CAS02处理，包括炭疽菌属（）、马赛菌属（）和诺维赫巴罗菌属（）等在内的11个细菌属显著高于CK，高丽菌属（）等9个细菌属与CAS02差异显著。

2.5.3 根际土壤环境因子与微生物群落的相关性分析 通过冗余分析（RDA，图5），进一步分析根际土壤化学性质与根际土壤细菌群落之间的关系。结果表明，RDA1和RDA2上的解释量分别为23.48%和14.19%，根际土壤速效磷和速效钾是影响根际土壤细菌群落的主要环境因子（表4），速效磷与优势菌群正相关，速效钾与优势菌群WCHB1-32负相关（图5）。由表3可知生物炭菌剂显著增加了根际土壤速效磷含量，但显著降低了速效钾含量，即生物炭菌剂通过改善土壤化学性质进而改变了优势菌群的相对丰度。

表2 不同试验处理条件下第25天烟株农艺性状

表3 不同试验处理土壤化学性质

图2 不同处理根际土壤细菌群落属水平的主坐标分析（PCoA）（a）和物种Venn图分析（b）

图3 不同处理根际土壤微生物属水平的群落组成及相对丰度

图4 不同处理根际土壤微生物属水平组间差异物种

注：OM，有机质；AN，铵态氮；NN，硝态氮；AP，速效磷；AK，速效钾。

表4 土壤化学性质与细菌冗余分析的相关系数

3 讨 论

生物炭作为一种营养元素丰富、孔隙发达、比表面积大且廉价易得的功能材料，可较好地负载生防菌，对土壤微生态环境具有积极的影响[18]。陶思远等[19]、QI[20]等研究发现，生物炭负载枯草芽孢杆菌SL-13能够提高菌体的性能，促进作物株高和叶片的生长，显著改善根际土壤微生态，对植物的生长产生积极的影响。

本研究中，花生壳生物炭呈弱碱性，营养较为丰富，具有较好的保水能力和多孔结构，可较好地发挥生物炭菌剂的载体作用；生物炭菌剂扫描电镜表征发现，生防菌CAS02可有效负载于生物炭孔隙中，且生物炭菌剂的负载量为25.31×108CFU/g。盆栽试验结果表明，单一施用CAS02虽在前期具有一定防控效果，但由于生防菌在土壤中定殖能力不稳定[7]等原因，后期防控效果严重降低，但生物炭负载菌剂可显著提高烟草黑胫病的防控效果且更为长效；生物炭菌剂的促生效果优于单施生物炭或CAS02生防菌，这表明以生物炭为CAS02的接种载体，既可提高生防菌的生防能力，也对植物的生长具有积极影响。

土壤理化性质与土壤微生物以及植物的健康生长有着密切关系[21]。本研究发现，生物炭菌剂可显著提高根际土壤速效磷含量，降低速效钾含量，生物炭菌剂通过改善根际土壤速效磷和速效钾含量，改变了优势菌群的相对丰度。UNG等[22]研究表明，增加土壤速效磷含量可以调节土壤养分有效性及土壤微生物组成，促进植物发育和对病害的抑制；而降低土壤速效钾含量影响了土壤微生物群落结构的变化并提高了作物的抗病性[23]。

植物病害与土壤微生物群落有着极其密切的关系[24-25]。本研究发现，生物炭菌剂显著改变了根际土壤细菌群落结构和属水平群落组成及相对丰度，这与魏萌萌等[26]研究结果中炭基Rs198菌剂的应用可以改善土壤微生物群落结构，增大相关土壤微生物群落的丰度，改善根际条件，最终促进作物生长的结果类似。其中生物炭菌剂显著提高了根际土壤优势菌群和WCHB1-32的相对丰度。ULLAH等[27]研究发现可通过诱导抗氧化酶活性，显著促进植物的生长和提高植物的抗病性。孙月等[28]发现，WCHB1-32能够参与难降解组分如木质素的分解，对根际条件进行有效改善，间接抑制植物病害发生。不同试验处理根际土壤差异细菌物种属水平研究发现，生物炭菌剂显著增加了根际土壤中、、和等菌群的相对丰度，这与抑制烟草黑胫病的发生有着密切的关系。前人研究表明，可有效抑制烟草黑胫病病原菌的生长[29]；对油菜菌核病有较强的防治作用[30]；和均具有抑制植物病害的潜在特性[31-32]。综上所述，生物炭菌剂通过根际土壤微生物区系的变化，提高了对烟草黑胫病的生防效应，但本研究仅采用了盆栽试验初步探究了施用生物炭菌剂对烟草黑胫病的防效及对根际土壤细菌群落的影响，关于生物炭菌剂在田间防治效果和对根际土壤真菌群落的影响还需深入研究。

4 结 论

结果表明，生物炭负载生防菌显著提升了对烟草黑胫病的防效且持效期延长。生物炭菌剂可提高烟株根际土壤速效磷含量、降低速效钾含量，改变根际土壤微生物群落结构及组成，增大、WCHB1-32和等有益菌相对丰度，增强了对烟草黑胫病的防治效果。本研究为生物炭为载体制备生物炭菌剂，开发防治烟草土传病害产品和根茎病害绿色防控提供了新思路。

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Effects of Carbon-Based Biocontrol Agents on the Occurrence of Tobacco Black Shank and Soil Microflora

JIA Haijiang1, FENG Junxi2, WU Tao3, ZHANG Xin4, SUN Tong2, HU Xihao5, WANG Peng5, LI Zhen4, CHENG Yadong4, CHENG Changxin3, LI Guizhong3, ZENG Xiangnan1*, ZHOU Zhaofeng1*

(1. Guangxi China Tobacco Industry Co., Ltd., Nanning 530001, China; 2. China Tobacco Shandong Industry Co., Ltd., Jinan 250014, China; 3. China Tobacco Yunnan Industry Co., Ltd., Kunming 650202, China; 4. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 5. Shandong Qingdao Tobacco Co., Ltd., Qingdao 266000, China)

The purpose of this study is to evaluate the control effect of a biochar bioagent on tobacco black shank disease and reveal its combined biocontrol mechanism. Biochar bioagent was prepared by loadingCAS02 on biochar carrier, and its loading effect was evaluated. Using the susceptible variety “Xiaohuangjin1025” as the test material, the prevention and control effects of different treatments of biochar bacteria on tobacco black shank disease were studied in an indoor pot experiment, and the relevant mechanism were analyzed from the perspective of soil chemical properties and microbial community structure. The results showed that: (1) Biochar could effectively support biocontrol bacteria CAS02 with a load of 25.31×108CFU/g, giving full play to the role of carrier. (2) The control effect of CAS02 on tobacco black shank disease decreased to 2.08% after 25 days of application, while the biochar bioagent was highly effective and sustained, and still maintained 43.75% relative control effect on the 25th day. (3) The application of biochar agent significantly changed the rhizosphere soil chemistry. Compared with CK, the content of available phosphorus in the rhizosphere soil under the BC-CAS02 treatment increased by 49.58%, while the content of available potassium decreased by 17.39%. (4) By comparing the amplicon sequencing in the 16 S V3-V4 region of each treatment, the biochar bioagent significantly changed the soil microflora structure, and the relative abundance of disease-inhibiting beneficial bacteria such as WCHB1-32,andsignificantly increased at the genus level. In conclusion, biochar bioagent can effectively improve the control effect of tobacco black shank disease by improving rhizosphere soil chemistry and microbial community composition.

biochar; biocontrol bacteria; tobacco black shank; soil microorganisms

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.010

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0068-08

广西中烟工业有限责任公司项目（GXZYCX2020B003、2022450000340066）

贾海江（1978-），男，硕士，主要从事烟叶基地管理与烟草生产工作。E-mail：jia053@163.com

，E-mail：曾祥难，zengxn000@163.com；周肇峰，574787000@qq.com

2022-06-23

2022-12-22