PD-1抗体对肥胖相关代谢紊乱的影响

吴玉呈，张青青

泰州市人民医院心内科1、内分泌科2，江苏 泰州 225300

近年来，肥胖的发病率在全球范围内迅速增加，它与糖尿病、心脑血管疾病以及感染和肿瘤的发生都有着密切的关联，给人类社会造成了巨大的经济、心理负担。目前研究已经证实肥胖所致的代谢紊乱及胰岛素抵抗是上述并发症产生和发展的中心环节，而肥胖状态下内脏脂肪组织中的代谢紊乱及慢性炎症反应则被认为是其导致胰素抵抗的重要病理生理机制[1]。目前有研究认为，肥胖患者体内脂肪组织的M1型巨噬细胞极化促进脂肪组织慢性炎症，从而导致胰岛素抵抗及糖代谢紊乱[2]。此外，通过特异性敲除脂肪细胞的MHC-Ⅱ分子来增加脂肪组织中Treg 细胞，可以在不影响小鼠体质量的情况下减轻肥胖引起的脂肪组织炎症和代谢紊乱[3-4]。程序性死亡受体-1(PD-1)及其配体(PDL)具有负性调节的协同刺激信号，PD-1/PD-L1信号通路在调节代谢方面具有重要作用[5]。本研究组前期研究显示肥胖患者的相关代谢指标水平显著高于正常对照组，外周血PD-1/PD-L1 水平高于正常对照组。因此推测PD1/PDL1对肥胖患者的代谢有一定的调节作用。本研究旨在探讨PD-1 对肥胖相关代谢紊乱的影响，为PD-1/PD-L1 通路治疗肥胖相关代谢紊乱提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只6周龄C57BL/6小鼠购自扬州大学比较医学中心，其中10只为正常小鼠(20～25 g，普通饲料)，20 只为肥胖小鼠(大于30 g，高脂饲料)。全部小鼠饲养于南京医科大学附属南京医院实验动物中心，环境温度为(20±2)℃；空气湿度50%～60%，小鼠自由饮水取食，12 h昼夜节律，及时清扫鼠笼及更换垫料。所有动物实验方法均经南京医科大学附属南京医院机构伦理委员会批准(1905292号)。

1.2 实验方法 将20 只肥胖小鼠随机分为肥胖组和肥胖+PD-1 组，每组10 只，再取10只普通小鼠作为对照组。对照组予以普通饮食及安慰剂注射，肥胖组予以高脂饮食及安慰剂注射，肥胖+PD-1组采用高脂饮食及PD-1 抗体腹腔注射，200 μg/只，间隔7 d 给予一次，共行4次治疗。

1.3 观察指标与检测方法 4周后采用全自动生化分析仪测定三组小鼠的空腹血糖(FPG)、胰岛素水平(Fins)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)和尿酸(UA)水平。肝脏甘油三酯含量检测采用南京建成生物科技有限公司的甘油三酯测定试剂盒(酶标仪比色法)进行检测。采用mRNA实时荧光定量PCR检测小鼠脂肪组织的巨噬细胞浸润情况。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 软件进行统计学分析。所有计量数据以均数±标准差(±s)表示，三组间计量数据比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，再采用Tukey'spost hoc 分析进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠的血糖、胰岛素水平比较 干预4 周后，三组小鼠的FPG 水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)；肥胖组和肥胖+PD-1 组小鼠的血浆Fins 和HOMA-IR 水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而肥胖组小鼠的血浆胰岛素和HOMA-IR水平分别与肥胖+PD-1 组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 三组小鼠的血糖及胰岛素水平比较（±s）

表1 三组小鼠的血糖及胰岛素水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.001。

组别对照组肥胖组肥胖+PD-1组F值P值HOMA-IR 14.34±2.25 80.25±12.60a 76.19±9.85a 4.443 0.001只数10 10 10 FPG(mmol/L)5.45±0.23 5.23±1.12 5.34±0.62 0.123 0.808 Fins(ng/mL)1.74±0.18 10.18±1.17a 9.71±1.01a 5.321 0.001

2.2 三组小鼠的肝肾功能及血脂比较 肥胖组小鼠的尿酸水平明显高于对照组，肥胖+PD-1 组小鼠的尿酸水平明显低于肥胖组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。肥胖组和肥胖+PD-1 组小鼠的甘油三酯、总胆固醇、HDL-C、LDL-C水平明显高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但肥胖+PD-1 组与肥胖组小鼠的上述指标比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。三组小鼠的ALT、AST、肌酐、尿素氮水平比较差异也均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 三组小鼠的肝肾功能及血脂比较（±s）

表2 三组小鼠的肝肾功能及血脂比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.001；与对照组比较，bP＜0.01；与肥胖组比较，cP＜0.01。

组别HDL-C(mmol/L)59.54±3.32 74.34±5.12a 72.43±4.12a 4.321 0.001只数对照组肥胖组肥胖+PD-1组F值P值10 10 10 TC(mmol/L)70.45±3.43 202.45±12.22a 204.32±11.55a 7.212 0.001 TG(mmol/L)92.30±7.32 288.30±24.36a 274.59±25.38a 6.332 0.001 LDL-C(mmol/L)13.23±1.12 62.44±5.32a 62.39±4.24a 4.323 0.001 ALT(U/L)66.65±15.43 71.49±11.40 59.32±21.22 0.832 0.27 AST(U/L)110.51±17.46 114.87±17.39 108.13±10.27 0.435 0.617肌酐(μmol/L)16.25±1.31 16.42±2.25 15.44±1.25 0.082 0.93尿素氮(mmol/L)41.29±3.24 37.09±5.24 40.49±6.59 0.898 0.122尿酸(mmol/L)104.78±25.42 143.56±29.29b 111.01±28.26c 3.434 0.001

2.3 三组小鼠的肝脏重量及内脏脂肪含量比较 肥胖组小鼠肝脏重量及肝脏重量/体质量比值明显高于对照组，肥胖+PD-1 组小鼠肝脏重量及肝脏重量/体质量比值明显低于肥胖组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。同时，肥胖组小鼠的肝脏甘油三酯含量明显高于对照组，肥胖+PD-1 组小鼠肝脏甘油三酯含量明显低于肥胖组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。肥胖组小鼠附睾白色脂肪组织(eWAT)重量及eWAT 重量/体质量比值明显高于对照组，肥胖+PD-1 组小鼠eWAT 重量及eWAT 重量/体质量比值明显于肥胖组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 三组小鼠的肝脏重量及eWAT重量比较（±s）

表3 三组小鼠的肝脏重量及eWAT重量比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与对照组比较，bP＜0.01；与对照组比较，cP＜0.05；与肥胖组比较，dP＜0.01；与肥胖组比较，eP＜0.05。

肝脏甘油三酯含量(mmol/gprot)3.21±0.56 6.23±1.23b 4.32±0.65d 3.127 0.003组别对照组肥胖组肥胖+PD-1组F值P值只数10 10 10肝脏重量(mg)911.23±79.43 1082.34±133.28a 904.34±60.23d 4.211 0.001肝脏重量/体质量(mg/g)38.33±2.23 43.45±5.56c 39.73±2.32e 2.287 0.027 eWAT重量(mg)196.20±15.10 744.20±113.61a 264.02±24.26cd 5.323 0.001 eWAT重量/体质量(mg/g)8.23±0.45 30.23±4.23a 11.21±1.21bd 4.665 0.001

2.4 三组小鼠脂肪组织的巨噬细胞浸润情况比较 肥胖组小鼠M1 巨噬细胞标记物(Itgax)和F4/80(Adgre1)mRNA 水平明显高于对照组，肥胖+PD-1 组小鼠Itgax 和Adgre1 mRNA 水平明显低于肥胖组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；肥胖+PD-1组小鼠的M2巨噬细胞标记物(Mrc1)mRNA水平明显高于肥胖组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 三组小鼠脂肪组织的巨噬细胞标记物mRNA水平比较（±s）

表4 三组小鼠脂肪组织的巨噬细胞标记物mRNA水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；对照组比较，bP＜0.05；与肥胖组比较，cP＜0.01；与肥胖组比较，dP＜0.01。

组别对照组肥胖组肥胖+PD-1组F值P值Mrc1 1.02±0.12 0.89±0.14 1.27±0.11d 5.563 0.001只数10 10 10 Itgax 1.07±0.13 1.57±0.23a 0.87±0.15c 5.231 0.001 Adgre1 1.03±0.11 1.37±0.13b 0.81±0.12c 2.317 0.027

3 讨论

肥胖会导致糖耐量异常、血脂水平升高、内脏脂肪含量显著增加以及胰岛素抵抗，本研究结果提示三组空腹血糖差异无统计学意义，但肥胖小鼠的空腹胰岛素水平明显高于对照组，考虑与肥胖引起显著胰岛素抵抗有关，这与既往研究结果相似[6-7]。此外，本研究还发现，尽管肥胖对肝功能、肌酐水平无明显影响，但能显著增加尿酸水平。目前肥胖引起尿酸水平增加的机制不明，可能与糖皮质激素过量引起的高胰岛素血症有关，因为高胰岛素血症减少了尿酸在肾脏近端肾小管的排泄，导致血尿酸水平升高[8-9]。既往研究显示糖皮质激素引起的肥胖与食欲增加有关，一项慢性应激的动物模型，发现糖皮质激素能够通过一系列相互关联的杏仁核-边缘系统-下丘脑事件导致对脂肪和碳水化合物的渴望增加[10]。

在本研究中，PD-1 抗体能够改善肥胖引起的内脏脂肪沉积。研究发现，PD-1 抗体可通过激活M2型巨噬细胞，增加白色脂肪组织中脂肪的利用和褐色变[11]。目前PD-1 抗体对脂代谢的作用观点不统一，有些学者认为PD-1 抗体可减少血浆甘油三酯，增加HDL-C[12]，但有些研究显示PD-1 抗体对甘油三酯和HDL-C没有显著影响[13]，这可能与上述研究所采用的不同动物模型有一定相关性。高脂小鼠模型的研究得到阳性结果的可能性要高于非高脂模型。此外，上述研究采用的PD-1 剂量及干预时间也有所差异，这可能也是结论不一的原因之一。本研究显示PD-1抗体并不能改善肥胖引起的高脂血症，与上述阴性结果研究存在一些相同点，如动物模型都不是直接的高脂模型，且干预时间较短。

据研究报道，脂肪组织浸润的巨噬细胞可能是促炎性细胞因子的主要来源[14-15]。本研究发现肥胖小鼠脂肪组织也存在巨噬细胞浸润，特别是M1 巨噬细胞，这可能是肥胖相关代谢紊乱的原因之一。本研究还发现PD-1抗体能改善肥胖小鼠脂肪组织中巨噬细胞浸润，并促进M1 型巨噬细胞转化为M2 型巨噬细胞，提示PD-1 抗体可以改善肥胖相关的脂肪组织慢性炎症。

综上所述，PD-1 抗体能够改善肥胖小鼠的内脏脂肪沉积和尿酸水平升高，抑制巨噬细胞在脂肪组织的浸润，有望成为预防和治疗肥胖相关代谢紊乱的新方向。