子宫内膜异位症大鼠在位及异位内膜组织中RAS与MEK的表达

王芳，王丽春，商丽红，陈华，李咏梅，哈春芳，5

1.宁夏医科大学临床学院，宁夏 银川 750004；

2.宁夏回族自治区人民医院妇产科，宁夏 银川 750004；

3.宁夏银川市妇幼保健院，宁夏 银川 750004；

4.宁夏医科大学总医院妇科，宁夏 银川 750004；

5.宁夏医科大学生育力保持重点实验室，宁夏 银川 750004

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是指伴随经血逆流的子宫内膜在宫腔外异质性生长形成的一种全身性慢性炎症性疾病，与慢性盆腔疼痛、不孕和月经紊乱有关。研究显示，大约10%的育龄期女性患有子宫内膜异位症，其中合并不孕症者约50%，严重影响患者的心理和社会福祉[1-2]。尽管付出了巨大努力，但子宫内膜异位症的病理生理学仍是生殖医学中的一个未解之谜。新近研究表明，该疾病的发展是多因素的，涉及激素、免疫、环境和遗传因素[3-4]。此外有研究报道，逆行子宫内膜细胞增殖、黏附和侵袭性增加所引起的生物表型变化促进了内异症的发展，因此，需要深入探索相关基因在EMs 中的致病机制并在此策略基础上开发新的药物治疗。

研究表明，原癌基因RAS蛋白作为丝苏氨酸蛋白激酶(MAPK)/ERK 途径的上游通路分子在促进恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学功能中起着分子开关的作用，但其在内异症中的具体作用机制未有报道[5]。MAPK 是丝氨酸-苏氨酸激酶，在细胞增殖、细胞黏附、血管生成、侵袭和转移中发挥重要作用。内异症相关研究显示：MAPK通路似乎在子宫内膜异位症细胞内和细胞外信号转导中起着关键作用。与健康女性相比，子宫内膜异位症患者在位内膜细胞增殖和存活的增强与MAPK 信号通路的异常激活有关[6]。本课题组前期通过表达谱芯片测序分析了子宫内膜异位症中差异基因表达，发现RAS、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)等因子显著上调，但两者在EMs中的表达及其作用机制尚不清楚。因此本研究建立子宫内膜异位症大鼠模型，旨在探讨EMs大鼠在位及异位内膜组织中RAS与MEK的表达水平及其与子宫内膜异位症发生发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雌性未孕大鼠20只，鼠龄6～8 周，体质量(200±20)g，购买并饲养于宁夏医科大学实验动物中心。模型组大鼠及对照组大鼠各10 只，各组间鼠龄和重量差异无统计学意义，该实验经由宁夏医科大学动物实验中心伦理委员会批准。

1.1.2 实验材料 兔多克隆抗体RAS(ab52939)和兔多克隆抗体MEK(ab178876)购自英国Abcam 公司。SYBR®Premix Ex Taq(RR820A)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)均购自日本TaKaRa 公司，BCA 蛋白提取试剂盒和蛋白检测试剂盒购自凯基公司。免疫组化检测试剂盒和DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型 建立大鼠清洁级环境饲养1周，手术前2 d 以戊酸雌二醇0.5 mg/kg 灌胃统一动情周期。自体移植法建模[7]：大鼠称重后1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。腹部备皮，常规消毒后于尿道口上方1 cm处切开长约2 cm 的纵行切口，逐层进腹，找到双角子宫，分离并剪下约1.5 cm 长的左侧子宫放入生理盐水中，冲洗干净后分离子宫内膜组织，并将其剪成5 mm×5 mm 大小四块，内膜面贴腹壁用6～0 可吸收线四角缝合固定于两侧腹壁血运丰富处，逐层关腹，待大鼠自然苏醒，其中对照组大鼠只开关腹不行内膜移植。术后肌注青霉素(1.6×105U/kg)连续3 d。术后4 周开腹观察移植物外观。造模成功标准：移植物体积增大，形成内含淡黄色清亮或者咖啡色液体的囊状结构，表面及周围或可见血管形成。

1.2.2 组织病理学染色(HE) 取EMs 模型组大鼠在位、异位内膜组织及对照组大鼠在位内膜组织，于4%多聚甲醛中固定48 h，常规石蜡包埋切片(厚度5 μm)、切片经脱蜡至水，苏木素染核、分化液分化、返蓝液返蓝、伊红染色、梯度酒精脱水及二甲苯透明，中性树胶封片后显微镜下观察。

1.2.3 免疫组织化学染色(IHC) 烤片后，组织切片经脱蜡、复水、微波抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，一抗MEK(1：500)、RAS(1：200)4℃冰箱孵育过夜，次日切片复温，兔二抗孵育，DAB 显色，苏木素染核，梯度酒精脱水，中性树胶封片后显微镜下观察各蛋白因子表达定位情况。

1.2.4 Western blot蛋白检测 取大鼠在位及异位内膜组织提取总蛋白，按照BCA蛋白检测试剂盒使用说明测定蛋白浓度。每个加样孔上样20 μg 蛋白，经电泳、PVDF膜转膜，室温封闭，一抗MEK(1∶20 000)、RAS(1∶5 000)、β-actin(1∶5 000)4℃孵育过夜。次日室温孵育，加抗兔二抗(1∶10 000)。加适量ECL增强液在BIO-RAD成像仪中进行发光，采用Image J软件对目的条带进行分析，根据曝光结果计算蛋白相对表达量。

1.2.5 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR检测RAS 及MEK mRNA 表达：提取组织中的总RNA，使用微量分光光度计检测RNA 浓度和纯度，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录PCR反应，融解曲线判断PCR反应的特异性，以GAPDH为内参，所得各样品Ct值利用公式计算各样品mRNA的相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学方法 所得数据均使用GraphPad Prism 7 统计学软件分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，两样本间比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA 分析，Pearson 相关分析法分析两者相关性。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EMs大鼠模型建立及异位病灶肉眼观表现 自体移植法建模及异位病灶肉眼观表现：移植物体积增大，形成内含清亮或者咖啡色液体的囊状结构，表面或周围可见新生血管及黏连形成，见图1。

图1 EMs大鼠模型异位病灶外观表现

2.2 EMs大鼠在位及异位的内膜形态 HE染色可见：与对照组大鼠相比，异位病灶组织见子宫内膜腺上皮细胞或者腺体生长，即为模型建立成功，见图2。

图2 EMs大鼠在位及异位内膜形态（HE染色，×200）

2.3 EMs大鼠内膜组织中RAS及MEK的表达定位 免疫组化结果显示：RAS 蛋白主要定位于子宫内膜腺体及腺上皮细胞的胞浆中，间质及胞核内少量表达。MEK主要定位于子宫内膜腺体的胞浆中，胞核内少量表达，见图3和图4。

图3 各组中RAS蛋白的表达（免疫组化染色，×400）

图4 各组MEK蛋白的表达（免疫组化染色，×400）

2.4 EMs大鼠内膜组织中RAS及MEK的表达比较 Western blot 结果显示：与对照组相比，EMs 大鼠在位及异位内膜组中RAS及MEK蛋白相对表达水平增高，且EMs 异位内膜组表达高于EMs 在位内膜组(FRAS=235.32，P＜0.001；FMEK=272.37，P＜0.001)，见图5和表2。

表2 RAS及MEK蛋白在三组内膜中表达水平比较（±s）

表2 RAS及MEK蛋白在三组内膜中表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与在位内膜组比较，bP＜0.01。

组别对照组EMs在位内膜组EMs异位内膜组F值P值MEK 0.50±0.05 0.94±0.08a 1.24±0.08b 272.37＜0.01例数10 10 10 RAS 0.32±0.10 0.86±0.08a 1.15±0.11b 235.32＜0.01

图5 Western blot 检测EMs 大鼠在位/异位内膜中RAS及MEK 蛋白表达

2.5 EMs 大鼠内膜组织中RAS 及MEK mRNA的表达比较 qRT-PCR 结果显示：与对照组比较，EMs大鼠在位及异位内膜组中RAS及MEK mRNA表达水平增高，且EMs异位内膜组表达高于EMs在位内膜组(FRAS=248.72，P＜0.001；FMEK=100.28，P＜0.001)，见表3。

表3 RAS及MEK mRNA在三组内膜中表达水平比较（±s）

表3 RAS及MEK mRNA在三组内膜中表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与在位内膜组比较，bP＜0.01。

组别对照组EMs在位内膜组EMs异位内膜组F值P值MEK 0.53±0.16 0.94±0.08a 1.24±0.08b 100.28＜0.01例数10 10 10 RAS 0.32±0.09 0.79±0.08a 1.08±0.06b 248.72＜0.01

2.6 EMs 大鼠在位/异位内膜组织RAS 与MEK蛋白表达水平的相关性 Pearson 相关分析结果显示：EMs 在位内膜组和EMs 异位内膜组中，RAS 蛋白与MEK 蛋白表达水平均呈正相关(r异位内膜组=0.68，P=0.032 3；r在位内膜组=0.79，P=0.006 9)，见图6。

图6 EMs大鼠在位/异位内膜中RAS与MEK的相关性

3 讨论

子宫内膜异位症作为一种常见的慢性炎症性激素依赖性疾病，影响全球数百万女性的健康和生活方式。迄今为止，子宫内膜异位症发生发展的确切病理生理学机制尚未确定，但证据表明，包括卵巢类固醇激素失衡、炎症、增殖侵袭表型功能转化在内的多种因素在子宫内膜异位症的发病机制中起着关键作用[8-9]。目前治疗方式上仍以手术结合药物治疗为主，但激素类药物的不良反应和手术后高复发率使得EMs的治疗仍面临巨大的挑战[10]。因此，探索EMs潜在发病机制及新的临床治疗靶点显得尤为重要。本实验采用自体移植法诱导建立EMs大鼠模型，旨在探讨RAS与MEK表达及其在内异症的发生中的相关性。

RAS蛋白激酶属于小GTP膜结合蛋白，被锚定在质膜的内表面，作为有活性的RAS-GTP 和无活性的RAS-GDP 有序循环的二元开关激酶在细胞信号转导过程中发挥作用[11-12]。研究报道，RAS 蛋白家族成员与主要下游信号通路如RAF/MAPK、PI3K/AKT 和细胞因子激活有关，从而在癌症和肿瘤中驱动异常信号，促进恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，是肿瘤治疗的靶点之一[13-14]。已有研究表明，异位内膜细胞增殖侵袭性增强与EMs的发病存在明显的相关性[15]，但EMs 患者异位内膜增殖侵袭性增强是否与RAS 蛋白激酶及其下游激酶活化相关尚不清楚。课题组前期表达谱芯片测序分析了子宫内膜异位症中差异基因表达：发现RAS、MEK蛋白表达水平显著上调，但两者在EMs 中的表达及其作用机制尚不清楚。本研究建立EMs 大鼠模型，免疫组化结果显示，RAS 蛋白在EMs在位及异位内膜的腺体、间质及腺上皮细胞中均有表达。Western-blot及qRT-PCR检测结果均显示：与对照组相比，EMs 在位及异位内膜组中RAS 蛋白及mRNA的表达量均增高，异位内膜组的表达水平高于在位内膜组(P＜0.05)，揭示RAS 蛋白激酶表达升高可能与EMs的发病存在一定的相关性，但其具体作用机制还需进一步研究。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)是丝氨酸-苏氨酸激酶，在细胞增殖、细胞黏附、血管生成、侵袭和转移中发挥重要作用。MEK是MAPK家族成员之一，活化后调控与肿瘤的发生发展密切相关的细胞增殖分化、细胞迁移、侵袭等多种生物学效应[16-17]。子宫内膜异位症为子宫内膜异位病变的生存提供了独特的微环境，包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡。而对于这些细胞活动，细胞内激酶的级联激活是必需的。越来越多的证据表明，子宫内膜异位症作为一个多因素调控的复杂的激素依赖性炎性疾病，MAPK激酶级联的异常活化在EMs发病关系中发挥了始动作用，但其具体作用机制仍然不清[18-21]。本研究免疫组化结果显示：MEK蛋白主要表达于子宫内膜腺体及腺上皮细胞的胞浆中。Western-blot及qRT-PCR检测EMs在位及异位内膜组中MEK蛋白及mRNA表达均显著增高(P＜0.05)，说明EMs中MEK蛋白处于过度活化状态，其可能与子宫内膜异位症的发生密切相关。肿瘤研究表明，活化的RAS募集级联反应并激活MAPK级联反应中的MEK1/2，使其完全激活进而活化各种下游应答分子，参与调控细胞增殖、侵袭、存活等多种细胞功能[22-23]。本实验从蛋白及基因水平证实RAS与MEK蛋白在EMs大鼠在位及异位内膜组织中高表达，进一步分析二者在EMs大鼠在位及异位内膜组织中表达均呈正相关，提示二者表达相辅相成，可能与子宫内膜异位症的发生密切相关，但其具体的调控机制有待于后续进一步研究。

综上所述，本实验结果证实RAS 与MEK 蛋白在EMs大鼠内膜组织中表达增高且呈正相关，推测子宫内膜异位症的发生可能与两者相互协同作用相关。后续本课题拟进一步通过临床组织水平及细胞水平验证RAS蛋白活化MEK表达影响EMs间质细胞增殖侵袭性的具体调控机制，为内异症的潜在治疗靶点提供系统深入的研究。