乳酸链球菌素工业生产过程的稳定性研究

王兆兰，李海军,2,3*，王 超，张英华，郑德强,2,3，马双双

（1.山东福瑞达生物科技有限公司，山东 临沂 276700；2.山东福瑞达医药集团有限公司，山东 济南 250000；3.山东省药学科学院，山东 济南 250000）

乳酸链球菌素（nisin）是某些乳酸链球菌产生的一种活性多肽物质，对人体安全无毒副作用，是一种安全、绿色、环保的生物防腐剂。Nisin的稳定性易受温度、pH、基质等影响[1]，不仅在一定程度上限制了其在食品加工中的应用，影响其最终抑菌效果[2]，更重要的是在工业大生产过程中影响产品的最终收率。目前在nisin的工业生产中，通常利用高温方式释放胞内nisin，并用盐酸调节其pH值，实现其提纯过程中的稳定性。虽然胞内nisin通过高温作用释放的过程较快，但大工业生产时因罐体体积较大，升、降温过程所需时间较长，造成nisin在高温、低pH条件下维持的时间较长，可能会导致稳定性下降[3]。为了提高nisin在工业生产过程中的稳定性，保证最终收率，本研究模拟工业生产条件，在40～120 ℃条件下考察不同温度和pH值对nisin稳定性的影响，重点研究产品提纯过程中使用不同酸对nisin在稳定性方面的影响，以优化其制备工艺。

在nisin的检测方法方面，目前最常用的为琼脂扩散法，此方法不仅受检测菌活性影响误差较大，而且检测周期也较长。本研究针对现有检测方法的弊端，开发使用高效液相法检测产品效价，有效提高产品检测效率，且准确度高，样品不被破坏[4]，更能在一定程度上反应效价下降的实质。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（安捷伦）；Sorvall RC-6型高速冷冻离心机（Thermo Fisher）；Seven Multi S40 pH计（梅特勒-托利多）；ZHJH-C1115B垂直超净工作台（上海智城分析仪器制造公司）；SHB-III型台式循环水式多用抽滤机（郑州长城科工贸）；LDZF-75KB-II型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安），HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒）。

1.2 材料与试剂

1.2.1 主要材料 乳酸链球菌素成品及半成品（山东福瑞达生物科技有限公司）；检测菌：黄色微球菌（NCIB8166）；S1培养基（青岛海博）。

1.2.2 主要试剂 乙腈（色谱级）；三氟乙酸（分析纯）；盐酸（分析纯）；乳酸链球菌素标准品（Sigma）；酵母粉（安琪酵母）、蛋白胨（吴忠市王国旗生物科技）；磷酸氢二钠（科密欧试剂）；氯化钠（科密欧试剂）；葡萄糖（诸城东晓生物科技）；吐温20（无锡亚泰联合化工）。

2 方法与结果

2.1 高效液相检测方法及验证结果

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相（A：90 %乙腈水溶液，三氟乙酸1 ml/L，B：10 %乙腈水溶液，三氟乙酸1 ml/L），洗脱时间见表1；检测波长：215 nm；柱温：30 ℃；流速：1 ml/min；进样量：20 μl。

表1 乳酸链球菌素洗脱时间表

2.1.2 标准品和样品处理 标准品处理：精确称量乳酸链球菌素标准品（效价约1000 IU/mg）20，40，60，80，100 mg，置入10 ml量瓶，0.02 mol/L盐酸水溶液定容并充分震荡溶解。上样前使用微孔滤膜过滤。

样品处理：将编号1～5的样品分别称量100，50，50，25，25 mg，置入10 ml量瓶，0.02 mol/L盐酸水溶液定容并充分震荡溶解。上样前使用微孔滤膜过滤。

2.1.3 标准曲线制作 按照上述色谱检测条件和洗脱方法进行检测，以仪器峰面积Y对乳酸链球菌素标准溶液浓度X（mg/ml）作标准曲线[5]。回归方程为Y=303.59X+16.958，相关系数r2=0.9992，表明在乳酸链球菌素标准品质量浓度为1～10 mg/ml范围内，乳酸链球菌素的质量浓度与峰面积之间具有良好的线性关系。

2.1.4 乳酸链球菌素效价按下式计算：

式中：C测：标准曲线测得的样液中乳酸链球菌素的质量浓度，单位mg/ml。C称：所称样品的质量浓度，单位mg/ml。效价单位IU/mg。

2.1.5 标准品及样品色谱图 分别对乳酸链球菌素标准品和样品采用同等条件进行检测。见图1。由图1可见，乳酸链球菌素的色谱峰约在20～21 min之间，能与其他物质有效分离。

图1 乳酸链球菌素高效液相色谱图

2.1.6 方法回收率及检出限 在乳酸链球菌素样品中添加乳酸链球菌素标准品，计算其加标回收率、RSD值及检出限。由表2可见，样品加标回收率达91 %以上，RSD值小于5 %，以3倍信噪比计算检出限为0.5 mg/ml。

表2 样品加标回收率

2.1.7 高效液相法与国标琼脂扩散法检测效价对比 将编号1～5的样品分别称量100，50，50，25，25 mg置入10 ml量瓶，用0.02 mol/L盐酸水溶液定容并充分震荡溶解，上样前使用微孔滤膜过滤；按照上述色谱检测条件和洗脱方法进行检测，并按照2.1.4项计算方法进行效价计算。高效液相法与国标琼脂扩散法（参见食品安全国家标准 食品添加剂乳酸链球菌素GB 1886.231-2016[6]）相比，其相对误差小于6 %（见表3），与琼脂扩散法相比误差小于10 %，表明高效液相法可用于乳酸链球菌素含量的检测[7]。

表3 高效液相法与国标琼脂扩散法检测效价对比

2.2 稳定性实验方法和结果

2.2.1 Nisin水溶液在不同pH、不同温度条件下的稳定性 将nisin半成品固体溶解成较高效价的溶液，等分5份，用盐酸调pH值分别为2.0，3.0，4.0，5.0和6.0，每份样品各分为3份密闭分装，分别置于65，75，85 ℃水浴锅内，定期取样使用高效液相法监测其效价。结果表明，在pH 2.0（图2A）和3.0（图2B）时，65～85 ℃条件下nisin水溶液的效价变化较小，pH 4.0（图2C）时，随着温度增加，效价稍有下降；pH 5.0（图2D）及6.0（图2E）时，随着温度增加，效价下降趋势明显。pH小于3.0时乳酸链球菌素在85 ℃依然稳定。

图2 不同pH条件下nisin水溶液稳定性

2.2.2 Nisin水溶液在pH 2.0、不同温度条件下的稳定性 因pH2.0时乳酸链球菌素较稳定，为了优化在工业生产过程nisin的生产工艺，现将溶液pH调节为2.0，于40，60，80，100，120 ℃条件下分别作用20，40，60，80，100 min，用高效液相法检测其效价。结果表明，pH 2.0时（图3），温度低于120 ℃，60 min以内nisin比较稳定，在120 ℃条件下维持60 min以上时，nisin效价明显下降。

图3 pH2.0条件下nisin水溶液稳定性

2.2.3 不同酸制备的nisin的稳定性 分别使用硫酸、磷酸、盐酸、乳酸调节nisin发酵液 pH为2.0～2.5，制备其成品粉末，于37 ℃放置，定期取样使用液相法检测其效价。结果：使用硫酸制备的nisin成品效价在一个月内下降55 %；使用乳酸和磷酸制备的nisin成品与对照（盐酸）相比，其稳定性明显提高。在37 ℃条件下放置3个月效价分别下降27.2 %和20 %，对照效价下降36 %（具体数据见图4）。

图4 不同酸制备样品效价变化趋势

2.2.4 Nisin样品稳定性图谱分析 将同一样品在37 ℃条件下分别放置1个月、2个月、3个月后，取少量样品存放于-20 ℃。3次留样使用高效液相法进行图谱分析（见图5）发现：随着在37 ℃条件下存储时间的延长，样品效价下降，且目标峰（保留时间22.5 min）之后的杂峰（保留时间24 min）占比也在相应的增加，表明乳酸链球菌素在一定条件下其性质有所改变，造成其效价下降。

图5 Nisin 37 ℃存储过程中杂峰变化趋势

3 讨论

本文用HPLC法检测是通过峰面积来表征活性，但因Nisin的活性受结构等诸多因素影响，为防止其在不同温度和酸碱度条件下因结构改变造成失活但仍出峰正常，在对实验样品活性衰减的定期监测过程中，同时使用琼脂扩散法进行监测，两种方法结果一致。然而是否在其他特殊情况下出现出峰正常但活性降低的现象还有待进一步研究。

考虑到在工业大生产过程中nisin溶液的升温、降温不能在短时间内精准实现，所以本文延长了考察时间并将考察的温度范围扩大，便于生产借鉴。不同温度和酸碱度条件下，nisin稳定性有较大差异，会直接导致工业生产过程中产品收率的波动，通过HPLC快速、准确地检测生产过程中nisin的效价，进而优化其工艺参数就显得尤为重要。本研究使用检测nisin效价的HPLC前处理步骤简单，仪器较普遍，不仅效率高、具有良好的可靠性，还能通过降解产物峰在一定程度上直观的体现其效价下降的原因[8]，可作为琼脂扩散法的良好补充。

为了更直接观察到nisin在不同条件下峰面积、效价的变化，本实验使用较高效价的nisin溶液进行考察，但带菌发酵液高温释放nisin的过程同样可使用本文所用的HPLC方法进行监测。另外本研究发现，在存储过程中，使用磷酸、乳酸制备的nisin成品比使用盐酸制备的nisin成品相对稳定，3个月内其稳定性分别提高16 %和8.8 %，这也为nisin的工业生产提供了新的思路，目前研究者们已经探讨了许多改善其活性的方法[9-10]，但同时考虑到产品生产成本等因素，还需做进一步的研究和探索。