子宫肌瘤患者血清和组织中hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-21-5p的水平与组织中ER，PR蛋白表达的相关性研究

籍 霞，王海波，李 萍（陆军军医大学士官学校附属医院妇产科，石家庄 050041）

子宫肌瘤是一种常见的妇科生殖系统的良性肿瘤，发病率高，约20%女性患有子宫肌瘤，好发于30～50 岁育龄期妇女[1]。目前而言，对子宫肌瘤的病因和发病机制尚未明了，可能与遗传易感性、性激素水平和生殖系统感染有关[2]。有研究证实，子宫肌瘤属于激素依赖性肿瘤，雌激素受体（estrogen receptor，ER）在子宫肌瘤组织中过表达，可以促进子宫平滑肌细胞的增生，如若降低ER水平，可以减小肌瘤直径，抑制子宫肌瘤生长[3]。孕激素受体（progesterone receptor，PR）作为ER 代谢后的最终产物，其分泌增多是子宫肌瘤发生的启动因子，在肿瘤组织中ER 介导染色体重构激活PR蛋白，进而诱导肿瘤细胞增殖，加快肿瘤发生的进度[4]。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一种非常特殊的内源性非编码RNA，序列非常短，大约由21～25 个核苷酸组成，有着超强的稳定性，在体内可以长期滞留，发挥调控作用[5]。有研究报道，miR-15 通过PI3K/ AKT信号通路靶向BMI1，从而抑制了膀胱癌细胞的进程，这为膀胱癌治疗提供了潜在的靶点[6]。另有研究指出，miR-21-5p 在肺癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，并且miR-21-5p 高表达与肺癌患者预后差，5年生存率低有关，可以作为判断肺癌患者预后的特异性标记物[7]。此外，miR-15 和miR-21 与胃癌、肾细胞癌、肝癌等多种恶性肿瘤的发展发生均有关系，具有潜在的临床应用价值[8]。然而hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p在子宫肌瘤这种良性肿瘤中的研究相对较少，并且它们与ER，PR 之间的相互调控作用也鲜有报道。因此，本研究主要通过检测子宫肌瘤患者血清和组织中hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p表达水平，分析它与ER 和PR 之间的相关关系，进而探讨hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p 在子宫肌瘤发生发展过程中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年8月～2020年12月于陆军军医大学士官学校附属医院妇科就诊的60 例子宫肌瘤患者作为研究对象，另选择60 例因子宫脱垂行子宫切除手术的患者作为对照。纳入标准：①经临床诊断确诊为子宫肌瘤的患者；②患者术前未接受放化疗以及使用激素类药物等；③本实验研究经本院伦理委员会批准，所有参与患者均知情并同意。排除标准：①并发其他肿瘤患者；② 患有自身免疫病者。本研究经过我院伦理委员会批准（编号：L201900354）

1.2 仪器与试剂 RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；ER，PR 兔抗人抗体，HPR 标记的羊抗兔IgG（Sigma 公司）；KH19A 型离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；荧光定量PCR 仪（日本Ta Ka Ra 公司）；蛋白电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化法观察子宫肌瘤患者ER，PR 蛋白阳性表达:收集患者子宫肌瘤组织和正常子宫肌层组织，放入10ml/dl 福尔马林中固定24 h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明后用石蜡包埋，将蜡块切成厚度为4 μm 的蜡片；蜡片脱蜡后用加入3ml/dl H2O2溶液孵育、封闭，使抗原位点暴露；封闭后加入ER，PR 一抗 4℃孵育过夜，二抗特异性结合一抗，室温孵育2 h，滴加DAB 显色液15 min，苏木素复染，脱水，封片。

在光镜下观察，ER 蛋白定位于细胞核，PR 蛋白定位于细胞质，出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每个切片选取10 个高倍视野计算阳性细胞率( 阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100% )，阳性细胞率＜10% 为0 分，10% ～25% 为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，＞75%为4 分；②染色程度：无色为0 分，黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。取两组计分之积：≤3 分为阴性，＞3 分为阳性。

1.3.2 WesternBlot 法测子宫肌瘤组织中ER，PR蛋白表达:称取一定量的子宫肌瘤组织和正常子宫肌层组织，加入裂解液后用组织匀浆机进行匀浆，待浆液充分裂解后，在 4 ℃，12 000 r/min 的条件下进行离心取上清液，用BCA 试剂盒检测各个样品中蛋白的浓度。若蛋白浓度相差过大，需要将样品的蛋白浓度调至一致。将调整后的样品加入loading buffer，混匀后煮沸10 min，恢复至室温后离心，配置8ml/dl 分离胶，在分离胶上面距顶端3 cm 处加入浓缩胶，加入蛋白样品后，80 V 浓缩，120 V 分离，电泳结束后转NC 膜2 h，脱脂奶粉室温封闭2 h，PBST 洗膜、加入一抗4 ℃孵育过夜，PBST 洗膜三次后加入二抗，室温孵育2 h，PBST 漂洗3 次后采用化学发光法进行显色，凝胶成像仪观察拍照，并用Image-J 软件分析各组蛋白相对表达。

1.3.3 qRT-PCR 检测患者血清和组织中hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p表达 :手术前采所有患者的空腹外周静脉血，离心取上清液，然后进行切除手术取患者的组织样本。严格按照试剂盒相关步骤分别提取血清和组织中的总RNA，提取结束后吸取2 μl RNA 样品用来检测其纯度，A260nm/A280nm的比值一般在1.6 ～1.8 之间即可；使用反转录试剂盒合成第一链cDNA，反应体系20 μl，逆转录反应条件：37 ℃ 15 min（反转录反应），85 ℃ 5s（反转录酶的失活反应）；用逆转录合成的cDNA作为模板进行RT-PCR 扩增，扩增体系为20 µl，其中SYBR Premix ExTaq Ⅱ（2×）10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μl，ddH2O25.5 μl，实时PCR 条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，循环35 次，72 ℃10 min，4 ℃保存备用；最后采用荧光定量PCR 仪进行实时荧光PCR 检测，以U6作为内参照，根据RT-PCR 反应结果中的Ct值，采用相对定量的方法比较，ΔCt=平均Ct目的基因－平均Ct管家基因,ΔΔCt=ΔCt实验样本-ΔCt对照样本,相对量=2-ΔΔCt。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行实验数据统计分析，计量资料符合正态分布的数据均以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用t检验；计数资料采用χ2检验，相关性分析用Pearson 法；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫肌瘤组织和正常子宫肌层组织中ER，PR蛋白阳性表达率比较 免疫组化结果显示，ER 蛋白定位于细胞核，子宫肌瘤组阳性表达率为73.3%（44/60），较正常子宫肌层组阳性表达率38.3%（23/60）显著升高（χ2=14.903，P=0.002）；PR 蛋白定位于细胞质，子宫肌瘤组阳性表达率为65.0%（39/60），较正常子宫肌层组31.7%（19/60）亦明显升高（χ2=13.348，P=0.005），差异均有统计学意义（P＜0.005）。

2.2 子宫肌瘤组织中ER，PR蛋白相对表达 Western-Blot 结果显示，与正常子宫肌层组比较，子宫肌瘤组织中ER(0.98±0.21 vs 0.62±0.15)，PR(0.80±0.14 vs 0.38±0.08)蛋白相对含量均显著增加,差异均有统计学意义（t=22.147，t=38.265，均P＜0.001）。

2.3 子宫肌瘤患者hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p mRNA 相对表达水平 见表1。qRT-PCR 结果显示，与正常子宫肌层组相比，hsa-miR-15b-5p，hsamiR-21-5p miRNA 在子宫肌瘤血清和组织中表达水平均显著增加，差异有统计学意义（均P＜0.001）。

表1 两组血清和组织中miRNA表达水平比较（±s，n=60）

表1 两组血清和组织中miRNA表达水平比较（±s，n=60）

样本项 目正常子宫肌层组子宫肌瘤组t 值P 值血清hsa-miR-15b-5p/U61.02±0.111.98±0.1246.080＜0.001 hsa-miR-21-5p/U60.93±0.182.21±0.1563.944＜0.001组织hsa-miR-15b-5p/U61.13±0.142.05±0.2039.852＜0.001 hsa-miR-21-5p/U61.05±0.172.26±0.2252.046＜0.001

2.4 子宫肌瘤患者hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p表达与ER，PR 表达的相关性 见图1 和图2。采用Pearson 法进行相关性分析，hsa-miR-15b-5p mRNA表达水平与ER，PR蛋白表达呈正相关，(r=0.780,0.744)；hsa-miR-21-5p mRNA表达水平与ER，PR蛋白表达亦呈正相关(r=0.902,0.898)，差异均有统计学意义（P＜0.001）。

图1 hsa-miR-15b-5p表达水平和ER，PR 表达水平相关性

图2 hsa-miR-21-5p表达水平和ER，PR 表达水平相关性

3 讨论

有关子宫肌瘤的病因迄今仍不十分清楚，可能涉及到正常肌层的细胞突变、性激素及体内细胞因子间的较为复杂的调控作用[9]。根据大量临床观察，女性在青春期前很少发生子宫肌瘤，随着绝经期的到来，女性开始出现“雌激素控制期”，在这个时期，女性自身的抑郁情绪很容易促使ER 分泌量增多，且作用加强，有时可持续几个月甚至几年，是造成子宫肌瘤产生的重要原因[10]。还有学者认为，生长激素与子宫肌瘤的发生也有关系，生长激素能够协同PR 促进有丝分裂，进而促进肌瘤的生长[11]。王波等[12]研究了米非司酮治疗子宫肌瘤对ER，PR的影响，结果发现，米非司酮对子宫肌瘤有良好的抑制作用，其机制可能是通过降低ER，PR 表达水平来发挥抗肿瘤作用。CIEBIERA 等[13]还报道了α-生育酚是维生素E 最活跃的形式，对子宫肌瘤而言，其含有结构决定因子，使得它们可能成为ER，PR的配体，当血清中α-生育酚浓度升高，ER 和PR亦随之升高，可能是女性患子宫肌瘤的一个重要危险因素。

miRNAs 作为具有调控作用的非编码RNA，其表达水平与多种癌症的发生相关，近年来发现它参与了细胞分化、基因调控、肿瘤发生等多种生物学功能[14]。miR-15 和miR-21 属于原癌miRNA，几乎所有的癌症都有参与，有研究表明，miR-15b 在肺癌组织中呈高表达，并在细胞有丝分裂周期中发挥调节作用；miR-21 通过抑制MAP2K3的表达，促进肺癌细胞增殖，影响肿瘤细胞的迁移和浸润能力，两者均在肝癌的发生发展中起重要作用，可以作为肺细胞癌的肿瘤标记物[15]。有研究报道，miR-21 参与了多个细胞周期调控通路，如PI3K/AKT 通路是细胞增殖和凋亡的重要通路，BCL-2 作为AKT的下游因子，具有细胞凋亡负调控作用，miR-21可以显著下调BCL-2水平，进而引起Caspase8 级联反应，最终诱导肿瘤细胞发生[16]。此外，大量研究结果表明，miR-21 作为致癌基因，在多种肿瘤细胞中均呈高表达，例如其在胶质母细胞瘤中的表达量是正常组织表达量的几十倍，在乳腺癌中的表达水平也有明显增加[17]。万晓龙等[18]报道了miR-15b-5p 的生物学功能，涉及更多的是调节肿瘤细胞生长与凋亡的功能，在不同肿瘤中有可能作为原癌基因存在，也可能作为抑癌基因发挥作用，例如在肝癌中表达上调，但在胃癌中其表达水平下调。还有学者通过数据库对miR-15b 靶基因进行预测，发现miR-15b 通过靶向调节MMP-3，Cyclin1 及CD28等来发挥对癌细胞增殖和凋亡的调控作用[19]。有关癌症发生过程中miRNAs 调控与性激素表达之间的相互作用也有研究。GAN 等[20]研究发现，子宫肌瘤患者血清 miR-21 表达显著高于对照组，说明miR-21 表达升高可能参与子宫肌瘤的发生,并且可作为临床诊断的参考指标。ER，PR 阳性患者miR-21 表达显著高于ER，PR 阴性患者，且ER，PR 不同表达与miR-21 表达均呈正相关性。

本研究发现，子宫肌瘤组织中ER，PR 蛋白呈阳性表达，子宫肌瘤患者血清和组织中hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p mIRNA表达水平也较正常子宫肌层患者表达水平明显升高，推测子宫肌瘤的发生发展与性激素ER，PR 之间存在着一定的诱导关系，并且hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p 具有作为子宫肌瘤标志性因子的潜力。同时本研究结果显示，hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p mRNA表达水平与ER，PR 表达水平呈正相关性，其原因可能是hsa-miR-15b-5p 和hsa-miR-21-5p 高表达促使ER，PR 分泌水平升高，进而协同诱导子宫肌瘤的发生发展。

综上所述，子宫肌瘤患者血清和组织中hsamiR-15b-5p，hsa-miR-21-5p表达水平均显著升高，其作用机制可能是hsa-miR-15b-5p，hsa-miR-21-5p与ER，PR 之间相互作用，共同影响的结果，但本研究只停留在基础实验，且纳入样本数量较少，后期还需扩大样本量，进行更深入的研究来阐明具体的调控机制，为子宫肌瘤的治疗提供强有力的理论依据。