妊娠糖尿病患者血清、脐血及胎盘组织中Visfatin和Chemerin的表达与胰岛素抵抗发生机制的研究

王 伟，张 静，浦 春（.阜阳市人民医院检验科，安徽阜阳 36004；.皖南医学院，安徽芜湖4000）

妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是在妊娠过程中发生或首次发现的不同程度的葡萄糖耐量异常，导致妊娠期间高血压、羊水过多和自然流产的发生率增加，异常胎儿发育、新生儿低血糖和死产的发生率显著增加[1]。部分GDM 患者在分娩后5 ～13年内患上2型糖尿病[2]。目前，关于GDM 的发病机理的研究相对较少。近年来，关于GDM 发病机理的研究取得了重大进展。孕妇妊娠期间的胰岛素敏感性会降低，并且人体的胰岛β细胞储备不足以弥补这一不足，产生的胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）导致葡萄糖和脂质代谢紊乱，诱发GDM[3]。研究发现[4]，GDM 的发生和发展与某些炎症因子和脂肪细胞因子有关。在人体中，脂肪组织可以分泌内脏脂肪素(Visfatin)、瘦素、内脂素、脂肪因子趋化素（chemerin）等许多脂肪细胞因子，其可以通过自分泌或旁分泌方法参与炎症、代谢疾病和心血管疾病的发生[5]。本研究主要探讨GDM 患者血清、脐血及胎盘组织中的Visfatin，Chemerin的表达变化及与患者发生胰岛素抵抗的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2018年12月～2020年4月阜阳市人民医院妊娠分娩的GDM 孕妇100 例作为GDM 组、糖耐量正常孕妇100 例作为NGT 组。GDM 组的年龄22 ～38 岁，平均年龄27.5±2.8 岁；孕前体质量指数（BMI）21.86±1.90 kg/m2；分娩时BMI 31.09±2.47 kg/m2；身高162.8±4.0 cm；分娩孕周39.5±1.1 周；收缩压122.8±6.9 mmHg；舒张压73.6±5.0 mmHg。NGT 组的年龄22 ～38 岁，平均年龄27.8±3.1 岁；孕前体质量指数（BMI）21.78±2.04 kg/m2；分娩时BMI 30.55±2.20kg/m2；身高163.2±3.8 cm；分娩孕周39.3±1.4 周；收缩压123.3±6.1 mmHg；舒张压75.0±5.7 mmHg。两组上述基线资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

纳入标准：①GDM 的诊断标准参考中华医学会推荐标准，以口服葡萄糖耐量试验（OGTT）作为基础：三项中的任何一项即可诊断GDM：（1）两次以上空腹血糖≥5.8mmol/L；（2）OGTT 试验中有2 项数据≥5.8mmol/L；（3）50g 葡萄糖负荷试验≥11.1mmol/L 及空腹血糖＞5.18mmol/L 即可诊断。②两组研究对象均在我院接受产前检查及分娩。③本研究涉及的检查项目及个人隐私资料均注意保密，均与研究对象签署知情同意书。④研究对象的年龄范围22 ～38 岁。排除标准：①生殖系统肿瘤；②生殖系统感染性疾病；③凝血功能疾病；④肝肾脏疾病；⑤妊娠期高血压；⑥单支预计综合征；⑦自身免疫性疾病；⑧多胎妊娠；⑨吸毒、酗酒；⑩甲状腺功能异常。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器及设备：内切式均浆器（IKA 公司，USA，型号：T10），台式低温离心机（Eppendorf公司，USA，型号：5404R），分光光度计（BIO-RAD公司，USA，型号：Smart SpecTM plus spectrophotometer）。

1.2.2 主要试剂：氯仿（分析纯，天津市化学试剂六厂，批号：20160322）；异丙醇（分析纯，天津市化学试剂六厂，批号：20170423）；TRIZOL（Invitrogen，15596-026）； 无水乙醇（ 分析纯，天津市化学试剂六厂，批号：20180116）；Oligo(dT)18（宝生物生物工程有限公司，货号：D511）；RNA 酶抑制剂（invitrogen，货号：10777-019）；d NTP 混合物（invitrogen，货号：18427-088）；EcoRI-HF（NEB 公司产品。货号：R3101）；BamHI-HF（NEB 公司产品，货号：R3136）；DNA 分子量标准（DL2000 plus，北京全式金公司产品）；Polybrene（sigma，货号：H9268）；实验细胞 ［3T3-L1 脂肪细胞（上海歌凡生物细胞库）］，高糖 DMEM，新生小牛血清( new calf serum，NCS)，0.25g/ml 胰酶，Penicillin-Streptomycin(双抗)( 10 000 U/ml)购自美国Gibco 公司；胎牛血清( fetal bovine serum，FBS)购自美国 Hyclone 公司；3 -异丁基-1-甲 基 黄 嘌呤( 3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX )，胰岛素，地塞米松购自德国Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 血糖、血脂指标检测：两组研究对象分娩前清晨抽取患者空腹静脉血5 ml，3 000 r / min 离心10min，分离血清。葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖（FPG）（日立7600 全自动生化分析仪）；Roche Cobase601 自动电化学发光免疫分析系统可检测空腹胰岛素（Fins）；糖化血红蛋白检测系统[爱科来医疗电子（上海）有限公司，型号HA-8180 /11204033]检测HbA1c；日立7600 自动生化分析仪检测总胆固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；抗胰岛素性稳态模式评估法（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）= FPG×Fins / 22.5，

1.3.2 血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 检测：脐带血获取：新生儿断脐后收集脐带血，离心取上清液，并保存在-80℃。双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清和脐血Visfatin和Chemerin表达水平，严格按照操作说明进行。Western blot 检测胎盘Visfatin，Chemerin 蛋白水平；在胎盘娩出后5min 内，无菌选择母体面中央1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm 的新鲜、未钙化的胎盘组织，用生理盐水冲洗，在玻璃匀浆器中压碎，在冰浴下加入裂解液30min，转移到离心管中，以10 000 r /min 在4℃下离心5min，取上清，BCA 法确定蛋白质浓度。蛋白通过SDS-PAGE 电泳分离，然后转移到PVDF 膜上，用TBST 冲洗，在室温下使用5g/dl 脱脂奶粉封闭1 h，添加兔抗人一抗工作液（抗Visfatin，Chemerin），并在4℃条件下孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗工作溶液，并在37℃下孵育1h，TBST 漂洗，显影。

1.3.3 3T3-L1 脂肪细胞培养：3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化。小鼠 3T3-L1 前脂肪细胞在含有 10%（v/v）NCS 和 100 U/ml 双抗的 DEME 培养液中培养。当细胞密度达到90% 传代接种到6 孔板，调整密度5×105，接触抑制2 天，计为诱导分化0 天。替换为新鲜培养液 DMEM + 10%FBS（2.5 m l/孔），分组加入诱导剂A（IBMX 0.5 mmol/L，胰岛素10 mg /L，地塞米松1.0μmol /L），混匀，3 天后换诱导剂B（胰岛素10mg/L），继续培养2 天，换基础培养基DMEM+10%FBS，培养至11 天，诱导分化为成熟脂肪细胞。

3T3-L1 前脂肪细胞在37℃，5ml/dl CO2的恒温培养箱中培养，根据细胞的生长情况定期更换培养液，将3T3-L1 前脂肪细胞培养3 ～4 天，融合率将达到80%以上，胰蛋白酶消化进行传代培养。

1.3.4 3T3-L1 脂肪细胞的生长观察：采取对数生长期生长细胞系，胰酶消化后，在24 孔培养板中每孔接种5×103个细胞，并置于5ml/dl CO2，37℃恒温培养箱中；每24h 随机选择3 孔细胞，消化后对其进行计数，并连续计数8 天，每天获取细胞数的平均值，以细胞数为纵坐标，以天数为横坐标，绘制细胞生长曲线。

1.3.5 3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖消耗实验：将3T3-L1 脂肪细胞接种到96 孔板中，诱导分化至第8 天后分别添加Visfatin，Chemerin 过表达及其空载体对照慢病毒培养5 天，通过葡萄糖氧化酶法分别测定各孔的葡萄糖含量，测定510nm 处的吸光度值（A值）。①从空白孔（无细胞接种的孔）中的糖含量平均值中减去培养液中葡萄糖含量的平均值以获得葡萄糖消耗。在一瓶葡萄糖工作剂中加入100ml 去离子水并充分混合； ②用1ml 工作溶液取几支试管，分别从标准液及 96 孔板的每个孔取 8μl 培养液加入含有 l ml 工作液的试管中混合均匀，置于37℃恒温水浴20min；从每个试管中取100μl 混合溶液加入96 孔板中；③计算测试溶液的葡萄糖浓度。葡萄糖浓度（mmol / L)=（待测液A值/标准液A值)×5.5mmol/L；葡萄糖消耗率（%）=干预组消耗葡萄糖/对照组消耗葡萄糖×100%，重复相同实验3 次，取平均值。

1.3.6 3T3-L1 脂肪细胞增殖的MTT 法：3T3-L1前脂肪细胞接种到96 孔培养板中，接种密度为1×104个/孔。细胞进入对数生长期后，计数每孔的细胞数，添加Visfatin，Chemerin 过表达及其空载体对照慢病毒进行MTT 实验。吸弃原培养液，用1×PBS 洗涤，加入5mg / ml MTT 溶液10μl/孔，37℃孵育4h，吸出上清液，并向每个孔中加入150μl 二甲基亚砜。检测490nm 波长处的A值。

1.3.7 Western-blot 检测Akt 及pAkt(Ser 473)蛋白：提取细胞的总蛋白：吸出培养瓶中的培养液，在每个孔中加入在4℃预冷的Hank’s 溶液0.5ml 洗涤细胞三次。每10μl 100mmol/L PMSF 加入1ml 裂解缓冲液，并在冰上摇匀。向每个孔中加入500μl 含PMSF 的裂解缓冲液冰上裂解30min，在4℃的冰箱中以12 000r/min 离心5min，分离上清，并保存在-20℃的冰箱中备用。BCA 法确定蛋白质浓度。蛋白通过SDS-PAGE 电泳分离，然后转移到PVDF膜上，用TBST 冲洗，在室温下使用5g/dl 脱脂奶粉封闭1 h，添加兔抗人一抗工作液TBST 稀释（Akt 1:1 000，pAkt 1:1 000），并在4℃条件下孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗工作液(l:4 000)，并在37℃下孵育1h，TBST 漂洗，显影。

1.4 统计学分析 统计学分析采用SPSS 21.0软件，两组的FPG，Fins，HbA1c，HOMA-IR，TC，TG测定值等数据采用均数±标准差（±s）表示，组间对比采用t检验；Visfatin，Chemerin水平与HOMA-IR 测定值的相关性分析采用Pearson 法；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDM 组和NGT 组的血糖、血脂代谢指标比较 见表1。GDM 组的FPG，Fins，HbA1c，HOMA-IR，TC 和TG 测定值均高于NGT 组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）；GDM 组和NGT组的HDL-C，LDL-C，ALB 测定值比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 GDM 组和NGT 组的血糖、血脂代谢指标比较（±s）

表1 GDM 组和NGT 组的血糖、血脂代谢指标比较（±s）

指 标GDM 组（n=100）NGT 组（n=100）t 值P 值FPG（mmol/L）5.84±0.524.61±0.4018.749＜0.001 Fins（μU/ml）18.96±3.7512.53±2.2014.789＜0.001 HbA1c（%）6.42±0.895.31±0.709.803＜0.001 HOMA-IR2.48±0.661.51±0.4212.399＜0.001 TC（mmol/L）5.22±0.574.86±0.494.789＜0.001 TG（mmol/L）2.41±0.432.18±0.344.196＜0.001 HDL-C（mmol/L）1.64±0.221.70±0.24-1.843 0.067 LDL-C（mmol/L）3.23±0.673.10±0.541.511 0.132 ALB（g/L）37.84±3.0238.44±3.30-1.341 0.181

2.2 GDM 组和NGT 组的血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 测定值比较 见表2，图1。GDM 组的血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 测定值均高于NGT 组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 GDM 组和NGT 组的血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 免疫印迹检测结果

表2 GDM 组和NGT 组的血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 测定值比较（±s）

表2 GDM 组和NGT 组的血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 测定值比较（±s）

样本 指标 GDM 组（n=100）NGT 组（n=100）t 值P 值血清 Visfatin（pg/ml）10.55±2.416.39±1.0515.825＜0.001 Chemerin（ng/ml）233.0±47.6155.7±30.613.660＜0.001脐血 Visfatin（pg/ml）9.87±2.266.11±0.9415.361＜0.001 Chemerin（ng/ml）438.1±95.0218.7±76.817.960＜0.001胎盘组织 Visfatin（/βactin）0.421±0.0930.235±0.07415.650＜0.001 Chemerin（/βactin）1.338±0.2070.905±0.15216.861＜0.001

2.3 GDM 组血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 测定值与HOMA-IR 的相关性 GDM组的血清、脐血、胎盘组织中的Visfatin(r=0.401,P＜0.001；r=0.386,P=0.001；r=0.357,P=0.003)，Chemerin(r=0.0.357,P=0.007；r=0.583,P＜0.001；r=0.496,P＜0.001)水平与HOMA-IR 测定值均呈显著正相关（P＜0.05）。

2.4 Chemerin，Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖消耗量、细胞增殖的关系 见表3。在细胞实验中，Chemerin 过表达组、Visfatin 过表达组的3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖消耗量均低于Chemerin空载组、Visfatin 空载组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Chemerin 过表达组、Visfatin 过表达组的3T3-L1 脂肪细胞增值A值高于Chemerin 空载组、Visfatin 空载组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 Chemerin、Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖消耗量、细胞增殖的关系（±s）

表3 Chemerin、Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖消耗量、细胞增殖的关系（±s）

过表达指标Chemerin 过表达组Chemerin 空载组t 值P 值Chemerin 葡萄糖消耗量（mmol/L）3.38±1.045.72±1.57-12.175＜0.001 3T3-L1 脂肪细胞增殖（A 值）1.104±0.3470.865±0.2715.319＜0.001 Visfatin 葡萄糖消耗量（mmol/L）3.14±0.985.80±1.62-13.765＜0.001 3T3-L1 脂肪细胞增殖（A 值）1.122±0.3160.875±0.2476.034＜0.001

2.5 Chemerin，Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞中Akt，pAkt 蛋白表达情况比较 见表4。在细胞实验中，Chemerin 过表达组、Visfatin 过表达组Akt，pAkt 蛋白相对表达强度低于Chemerin 空载组、Visfatin 空载组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 Chemerin，Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞中Akt，pAkt 蛋白表达情况比较（±s，/βactin）

表4 Chemerin，Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞中Akt，pAkt 蛋白表达情况比较（±s，/βactin）

类 别Chemerin 过表达组Chemerin 空载组t 值P 值Chemerin Akt 蛋白1.319±0.2081.649±0.233-10.352＜0.001 pAkt 蛋白1.028±0.2111.421±0.265-11.367＜0.001 Visfatin Akt 蛋白1.284±0.1951.628±0.202-12.005＜0.001 pAkt 蛋白1.007±0.1861.443±0.193-15.938＜0.001

3 讨论

3.1 GDM 研究现状 目前GDM 的发病机制仍不清楚，有学者认为，IR 和妊娠期胰岛β细胞功能的不足可能是GDM 发病机制中的两个关键因素[7-8]。GDM 和肥胖症具有许多相似的病理生理特征，例如脂肪营养不良、葡萄糖耐量降低和高凝性。这种生理变化与脂肪细胞分泌的某些因素有关，研究脂肪细胞因子可对进一步探讨GDM 的发病机制有所帮助。

3.2 GDM 与血糖、血脂代谢指标的关系 本研究结果显示，FPG，Fins，HbA1c，HOMA-IR，TC，TG 指标与GDM 有一定的联系，对GDM 的诊断具有重要的临床价值。FINS 与孕妇的血糖水平和胰岛功能有直接关系，也可以反映胰岛素抵抗，其水平越高，胰岛素抵抗越强，不利于人体对高血糖水平的有效调节，引起血脂和血糖代谢紊乱，这很容易发生GDM。HbA1c 是糖尿病监测最佳指标之一，是葡萄糖和血红蛋白在体内通过不可逆和非酶促反应结合而成的糖蛋白，与人体血糖水平呈正相关，可以有效反映血糖水平，灵敏度高[9]。HOMA-IR是评估胰岛素敏感性的指标。

3.3 Chemerin，Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖消耗量、细胞增殖的关系 本研究中，GDM 组的血清、脐血和胎盘组织中的Visfatin，Chemerin 测定值均明显高于NGT 组。推测Visfatin和Chemerin 可能参与胎儿宫内生长发育的调节，并且Visfatin和Chemerin 可能作为保护因子，是机体对高血糖应激状态的代偿反应，在胰岛素缺乏的情况下，Visfatin和Chemerin水平增加可能对GDM 患者具有保护作用。Chemerin 是一种以非活性的pro-chemerin 前体形式分泌的蛋白质，pro-chemerin 的生物学活性非常低，需要被细胞外凝血酶、纤溶酶和炎症级联反应裂解，以形成具有生物活性的16kDa Chemerin 发挥生物学功能[10]。研究表明[11]，Chemerin 与受体结合后它可以在调节脂肪分化、产生和代谢、参与炎症、先天免疫和调节糖代谢方面发挥生物学作用。研究表明[12]，Visfatin 可以由孕妇、胎儿组织和胎儿附属物产生和分泌，这是妇女在怀孕期间适应性变化和胎儿生长发育的重要调节剂。关于Visfatin 在胎盘组织中表达的研究相对较少。在正常妊娠中，Visfatin 在羊膜上皮细胞、间充质细胞、绒毛膜滋养细胞和胎膜顶蜕膜中表达，并随着胎龄的增加其表达也增加[13]，Visfatin和Chemerin 参与胰岛素抵抗的过程，胰岛素抵抗与肥胖密切相关。Visfatin和Chemerin 的增加可能是机体的代偿性增加以适应全身性代谢紊乱，而其水平的增加可以帮助改善胰岛素抵抗。妊娠糖尿病的发病机理尚未完全了解，目前认为胰岛素抵抗和慢性低水平炎症在妊娠糖尿病的发病机理中起着非常重要的作用[14]。脂肪组织是人体的主要能量储备器官和体内最大的内分泌器官，参与肥胖、糖和脂类代谢，是发生胰岛素抵抗的关键环节[15]。脂肪细胞功能缺陷导致胰岛素抵抗的发生，3T3-L1 前脂肪细胞是具有单个分化潜能的细胞系，可以在体外诱导分化为成熟的脂肪细胞，可以更好地模拟脂肪细胞的分化[16-17]。因此，3T3-L1 前脂肪细胞株广泛用于与糖和脂质代谢有关的研究。在该实验中，成功培养了3T3-L1 前脂肪细胞，为下一步Visfatin，Chemerin 对3T3-L1 前脂肪细胞的干预及进一步的机理研究奠定了基础。葡萄糖消耗是指整个细胞在正常生理活动的一定时期内将葡萄糖转化为其他物质的能力，可以用于评价所有与葡萄糖转运和代谢有关的蛋白质功能[18]。本研究显示，Visfatin，Chemerin 可能导致脂肪细胞葡萄糖利用减少，发生胰岛素抵抗，但与脂肪细胞葡萄糖的利用、干扰胰岛素信号通路的关系需要进一步研究。本实验通过建立细胞生长曲线，观察3T3-L1 脂肪细胞增殖生长情况，发现Chemerin，Visfatin 可能具有促进前脂肪细胞增殖的作用，验证本研究的猜想。

3.4 Chemerin，Visfatin 过表达与3T3-L1 脂肪细胞中Akt，pAkt 蛋白表达情况的分析 胰岛素与相应的受体结合后，可以激活下游信号[19]，参与葡萄糖转运、糖异生抑制、糖原合成、糖酵解、蛋白质合成等过程[20]。AKT 通过调节葡萄糖转运蛋白的转运来介导细胞对葡萄糖的吸收，通过调节糖原合酶激酶3 来促进糖原合成[21]。因此，AKT 活性的调节将对细胞葡萄糖代谢产生重要影响。在细胞实验中，Chemerin 过表达组、Visfatin 过表达组Akt，pAkt 蛋白相对表达强度明显低于Chemerin 空载组和Visfatin 空载组。提示Visfatin和Chemerin 可能通过调控胰岛素信号通路中Akt的表达水平导致胰岛素抵抗。相应机制可能是pAkt 的降低导致其下游葡萄糖转运蛋白GLUT4 向细胞膜的转运减少，糖原合成酶激酶3（GSK3）丝氨酸位点磷酸化降低，活性增强，肝糖原合成抑制，转录因子PGC-1α 的磷酸化降低，增加糖原输出。

本研究首次联合Visfatin，Chemerin水平变化与胰岛素抵抗、肥胖的关系进行研究，探讨二者在妊娠糖尿病发病中的作用及机制，并且本研究证实Visfatin，Chemerin 可能通过调节Akt，pAkt 蛋白表达影响 3T3-L1 脂肪细胞的增殖及糖脂代谢，这为后期GDM 患者胰岛素抵抗的发生及早期预测提供了参考，有利于诊断和治疗，具有较好的研究价值。但本研究存在一定的不足，样本量较少可能影响研究结果，可以进一步加大样本进行验证。

综上所述，GDM 患者血清、脐血、胎盘组织中Visfatin，Chemerin表达水平显著升高，并且与胰岛素抵抗有正相关性，其作用机制可能与下调Akt，pAkt 蛋白表达有关。