血清游离胆汁酸CA，LCA及胎盘HIF-1α表达水平与ICP患者不良妊娠结局的相关性研究

王 彤，曾观银，徐凤丹，罗 虹，高博翰，谢树锋，程楚云（广东省东莞市第八人民医院/东莞市儿童医院.产科；.ICU,广东东莞 523325）

妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是中晚期妊娠的特殊并发症，主要表现为血清总胆汁酸（total bile acid,TBA）升高，伴随着黄疸、肝功能异常、皮肤瘙痒等，同时对胎儿产生一定程度的危害，可导致新生儿早产、胎儿窘迫、羊水粪染甚至死胎等一系列危害[1-3]。血清TBA升高（≥10μmol /L）伴有皮肤瘙痒是诊断ICP 的重要依据，但无症状高胆汁酸血症(asymptomatic hypercholanemia of pregnancy，AHP )孕妇亦表现为血清TBA 升高，但不伴随其他临床症状。研究[4]发现，ICP 和AHP 具有不同的围产期结局，及时鉴别诊断出ICP 并进行干预治疗，对于改善妊娠结局具有重要意义。有研究[5]表明，ICP患者胎盘组织中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）呈高表达，但是HIF-1α 与ICP 的研究较少，怀疑其可能与ICP患者不良妊娠结局有关。本研究通过研究AHP 和ICP患者胎盘HIF-1α mRNA表达水平，并采用超高效液相色谱串联质谱仪检测不同胆汁酸亚型，旨在鉴别出能有效辨别AHP 和ICP 的胆汁酸亚型，分析影响不良妊娠结局的独立相关因素。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选择2020年3月～2021年4月于广东省东莞市第八人民医院就诊的产妇作为研究对象，其中妊娠期肝内胆汁淤积症患者48例为ICP 组，平均年龄28.85±5.84 岁，BMI 29.24±2.76Kg/m2，孕周33.72±0.86 周，孕次1.08±0.24 次。同期无症状高胆汁酸血症70 例为AHP 组，平均年龄28.37±6.02 岁，BMI 29.65±2.63Kg/m2，孕周33.57±0.97 周，孕次1.13±0.21 次。两组产妇的年龄、BMI 值、孕周以及孕次间均无显著差异，两组研究对象具有可比性。

纳入标准：①ICP 组患者均符合2015《妊娠期肝内胆汁淤积症诊疗指南》中的诊断标准[6]，AHP组患者仅表现为血清 TBA 升高（空腹血TBA ≥10 μmol/L），但无黄疸、皮肤瘙痒且肝功能各项指标无异常；②胎位正常（头位）、单胎；③无肝胆疾病、无免疫系统疾病、血糖正常。排除标准：①胎位异常、多胎妊娠；②患有肝炎、胆囊炎或胆管堵塞等其他疾病；③伴有妊娠期高血压、妊娠期糖尿病等妊娠期并发症；④因其他病因引起皮肤瘙痒；⑤伴有良恶性肿瘤。两组研究对象具有可比性，本研究经我院伦理委员会审核通过，所有研究对象均自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 HIF-1α 抗体购自博士德生物工程有限公司；二抗显色液购自广州安必平医药科技股份有限公司。血清中TBA，ALT，AST水平用全自动生化分析仪（东芝TBA120）检测；血清胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA）、鹅脱氧胆酸（DCA）、熊脱氧胆酸（UDCA）、石胆酸（LCA）水平用超高效液相色谱串联质谱仪（ACQUITY UPLC I-Class IVD / Xevo TQ-S IVD System）检测；胎盘组织HIF-1α的表达水平使用免疫组化技术检测。

1.3 方法

1.3.1 血清采集：所有研究对象于分娩前抽取其空腹静脉血，分离血清于-80℃保存，使用全自动生化分析仪检测产妇的肝功能指标，使用超高效液相色谱串联质谱仪检测产妇的不同胆汁酸亚型。

1.3.2 胎盘组织HIF-1α 采集与处理： 孕妇生产娩出胎盘后30min 内，无菌操作取胎盘母体近端胎盘（尽量避开组织钙化区域以及坏死区域）组织3块，约2.5cm×2.5cm×2cm 大小。采用10ml/dl 中性甲醛固定胎盘组织，石蜡包埋切片，经过脱蜡水化抗体修复后行免疫组织化学染色。血清封闭后加入HIF-1α 抗体，4℃过夜。PBS 洗涤3 次×5min，滴加二抗，37℃孵育1h，PBS 洗涤3 次×5min 后显色液显色，封片，镜下观察。

胎盘组织HIF-1α的表达判定标准为：HIF-1α 主要表达于细胞浆和细胞核，阳性着色呈黄色、棕黄色、褐色等。根据其着色程度分为：0 分为无色，1 分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为褐色；根据阳性细胞占比分为：阳性细胞占比≤10%为1 分，占比11%～50%为2 分，占比51%～75%为3 分，占比＞75%为4 分。HIF-1α表达计分=着色程度评分×阳性细胞占比评分，总分0～12 分，＜3 分为阴性，用“-”表示；总分3～5 分为弱阳性，用“+”表示；总分6～9 分为阳性，用“++”表示；总分大于9 分为强阳性，用“+++”表示。

收集围产期结局，记录两组产妇分娩结局，包括早产、胎儿窘迫、羊水粪染程度、新生儿Apgar评分、入住新生儿重症监护室（neonatal intensive care unit,NICU）的发生率。

1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS 22.0 进行统计学分析，计量资料如年龄、BMI 值等采用均数±标准差（±s）表示，组间差异采用t检验；计数资料如不良妊娠结局的发生率等采用率表示，组间差异采用卡方检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。采用Logistic 回归分析影响不良妊娠结局的影响因素，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能指标和胆汁酸水平的比较 见表1。两组产妇TBA，ALT，AST水平间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。ICP 组产妇CA，LCA水平显著高于AHP组，差异具有统计学意义（均P＜0.001）。

表1 肝功能指标和胆汁酸水平的比较（±s）

表1 肝功能指标和胆汁酸水平的比较（±s）

项目ICP 组（n=48)AHP 组（n=70) t 值 P 值TBA（μmol/L)46.54±6.5847.21±6.38 0.639 0.524 ALT(U/L)38.26±5.3736.58±5.72 1.889 0.061 AST(U/L)28.48±3.5428.92±3.85 0.745 0.458胆汁酸：CA(μmol/L)3.78±0.631.24±0.56 26.100＜0.001 LCA(μmol/L)7.86±0.541.13±0.17 113.936＜0.001 DCA(μmol/L)4.72±0.524.57±0.491.829 0.069 CDCA(μmol/L)3.86±0.543.74±0.491.428 0.155 UDCA(μmol/L)11.64±1.2812.96±2.69 1.639 0.116

2.2 两组胎盘组织HIF-1α 阳性表达率的比较 ICP组产妇胎盘组织HIF-1α 阳性表达率为68.75%（33/48），AHP 组产妇胎盘组织HIF-1 阳性表达率为41.43%（29/70），差异具有统计学意义（χ2=12.359,P=0.006）。

2.3 妊娠结局的比较 见表2。ICP 组产妇分娩的新生儿体重较AHP 组轻、身长较小，差异均具有统计学意义（t=3.468,3.399,均P＜0.05）；ICP 组不良妊娠结局的发生率显著高于AHP 组，差异具有统计学意义（χ2=5.591,P=0.018），其中ICP 组入住NICU、羊水粪染以及医源性早产的发生率显著高于AHP 组，差异具有统计学意义（χ2=4.936,11.011,7.223,P=0.018）。

表2 妊娠结局的比较[±s,n（%）]

表2 妊娠结局的比较[±s,n（%）]

项目ICP 组（n=48)AHP 组（n=70) t/χ2 值 P 值体重（g）3152.6±362.4 3357.4±371.3 3.468 0.001身长（cm)48.3±1.649.6±1.73.399 0.001性别（男/女）25/2338/320.038 0.846 Apgar 评分＜7 1 min2(4.17)4(5.71)0.141 0.707 5 min1(2.08)1(1.43)0.073 0.787不良妊娠结局24(50.00)20(28.57)5.591 0.018 NICU9(18.75)4(5.71)4.936 0.026胎儿窘迫1(2.08)5(7.14)1.510 0.219羊水粪染12(25.00)3(4.29)11.011 0.001早产 自发性5(10.42)7(10.00)0.894 0.344医源性13(27.08)6(8.57)7.223 0.007

2.4 不良妊娠结局的独立相关因素 见表3。根据ICP 产妇是否发生不良妊娠结局，采用多因素Logistic 回归分析其影响因素。多因素Logistic 回归分析结果中，TBA，CA，LCA 以及HIF-1α 与不良妊娠结局间具有相关性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 不良妊娠结局的独立相关因素

3 讨论

ICP 是造成妊娠期妇女肝脏损伤的常见病因，增加了胎儿窘迫、低出生体重、羊水粪染、早产的发生率，甚至可造成死胎、死产。TBA 升高是诊断ICP 的重要依据，AHP 孕妇亦表现为TBA 升高，但是对妊娠结局、围生儿预后并无显著影响。近年来随着ICP 的发病率不断增高，严重影响了出生人口质量[7]，有效、及时鉴别诊断ICP 并进行干预成为当今临床研究的热点。

目前临床上对于ICP 的诊断存在两种过激倾向[8-11]，当空腹TBA ≥10μmol/L 确诊为ICP 后，部分医生出于尽早防止胎儿窘迫甚至死胎的发生，会选择剖宫产提前终止妊娠，提高了医源性早产、剖宫产的发生率；另一种情况是采取期待疗法，根据B 超、胎心监测结果，尽量延长孕周、鼓励阴道试产，产妇一旦出现缩宫，胎儿缺氧情况加重可能会窒息，甚至可导致围产儿死亡。目前关于AHP 在国内外的研究较少，且对ICP 的发病机制及规律的认识尚存在一定的局限性，探讨能有效识别影响产妇不良妊娠结局的相关因素至关重要。AHP 和ICP均表现为TBA水平升高，TBA水平升高可能导致胆汁淤积，是对胎儿及产妇造成损害的重要原因[12]。本研究中，AHP 组和ICP 组产妇血清TBA水平均显著升高，但是ICP 产妇AST，ALT水平较AHP组显著升高。采用超高效液相色谱串联质谱仪检测胆汁酸亚型，结果表明，ICP患者CA，LCA水平较AHP 显著提高，可作为鉴别ICP 和AHP 的有效指标。既往有研究[13]表明，ICP患者的多种胆汁酸亚型水平会有大幅度的提升，胆汁酸类包括CA是主要升高的亚型。ICP患者鹅脱氧胆酸水平数倍升高，LCA 是鹅脱氧胆酸在肠内经过脱羟基生成的单羟基胆汁酸，与鹅脱氧胆酸水平存在正相关性，ICP患者LCA水平亦显著升高，与本研究结论一致。

缺氧诱导因子（HIF）包括α，β 亚基组成的二聚体转录因子，其中HIF-1α 是功能亚基，可以根据氧浓度进行调控直接影响HIF 活性，在机体缺氧应答、保持机体生理功能中发挥重要作用[14-15]。有研究[16]表明，HIF-1α 通过调控VEGF 参与胚胎血管生成，同时影响缺氧环境下的代谢功能及滋养层细胞功能达到调节妊娠胚胎生长的作用，在胚胎的发育、生长中扮演重要的角色。有学者[17]发现，先兆子痫产妇胎盘HIF-1α mRNA表达水平、HIF-1α 蛋白表达水平以及与DNA 的结合活性均显著升高。本研究结果表明，ICP 产妇胎盘HIF-1αmRNA表达水平较AHP 显著提高，表明ICP 产妇胎盘组织存在显著的缺氧，处于低氧应激状态。ICP 组中，不良妊娠结局的发生率显著高于AHP 组，与文献[18-20]发表的结论一致。多因素Logistic回归分析结果表明，ICP 组产妇肝功能指标包括TBA，AST 以及ALT 均是影响不良妊娠结局的独立相关因素。有研究[21]表明，根据肝功能指标将ICP 分成不同的亚组，重度组不良妊娠结局的发生率明显高于轻度组，与本研究结论一致。

本研究初步探究了不同胆汁酸亚型辨别AHP，ICP 的作用，但是本研究纳入的病例有限，且产妇妊娠过程中，不同胆汁酸亚型水平呈动态变化，本研究仅仅选取了孕晚期的患者作为研究对象，仍需进一步扩大样本量进行队列研究。本研究中，HIF-1α 是影响ICP 产妇不良妊娠结局的独立危险因素，但是与各不良妊娠结局间的相关性尚需进一步论证。综上所述，游离胆汁酸CA，LCA 是鉴别ICP和AHP 的有效因素，HIF-1α 是影响ICP 产妇不良妊娠结局的独立相关因素。