环境DNA宏条形码在生物多样性研究与监测中的应用

康子清 张银龙，2 吴永波，2 谢冬 薛建辉 华建峰

（1. 南京林业大学生物与环境学院，南京 210037；2. 南京林业大学江苏省南方现代林业协同创新中心，南京 2100037；3. 中国科学院江苏省植物研究所（南京中山植物园），南京 210014）

生物多样性是地球上的生物与其生存环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和，维持着全人类所依赖的所有尺度上的生态系统，其变化会对生态系统功能产生影响，并通过生态服务系统进而影响人类获取福利的大小［1］。由于人类活动加剧，对自然环境干扰加强，全球生物多样性持续下降成为了21世纪人类面临的挑战之一［2］。保护生物多样性，做到防患于未然的第一步就是要做好生物多样性监测。目前几乎所有防止外来物种入侵、保护生物多样性的措施都依赖于物种监测，物种监测是监测生物多样性与生态环境变化中应用最为广泛的方法［3-4］。然而物种监测传统上依赖于物理识别，即通过物种其独特的形态特征来进行目视调查计数。这种传统的物理识别有两个弊端，其一是需要非常专业的分类学知识［5］；其二是部分传统的调查方法会对当地的自然环境有所破坏，尤其是海洋调查［5-6］。可见传统的物种监测方法已然限制了全球生物多样性的研究与环境保护工作，因此急需新技术来进行大规模的生物多样性监测与研究。

随着高通量测序技术不断的发展，诞生了可以快速进行生物多样性监测的环境DNA宏条形码技术，对传统监测技术过程中存在的难题提供了一种方便快捷的解决方法，在大规模的生物多样性监测与研究中展现出了很好的应用前景。本文概述了环境DNA宏条形码技术操作流程，并从水环境、土壤环境与空气环境的角度对国内外环境DNA宏条形码技术研究进行了总结，以期能为后续生物多样性研究与监测研究提供新的思路和启发。

1 环境DNA与环境DNA宏条形码技术

环境DNA是指生物体内活细胞和胞外DNA衰落死亡或细胞结构破坏，最终排放到环境中且不对任何目标生物进行分离的DNA［7-8］。最早于19世纪80年代由美国科学家Ogram等［9］提出，他在沉积物实验中首次提取出微生物DNA，但直到20世纪后环境DNA的概念才得到学者的广泛认可。

基于DNA的物种鉴定方法的出现也为后续环境DNA宏条形码技术的发明与发展打下了坚实的基础。Hebert等［10］于2003年首次提出了DNA条形码技术，认为可以通过一种基因序列来鉴别不同物种，他利用动物线粒体中的细胞色素c氧化酶第一亚基（COI）基因对13 320个动物物种进行分析研究，发现其基因序列可以区分所研究物种。随后DNA条形码的概念被引入植物学、微生物学中。DNA条形码技术是利用不同物种在特定基因上存在的差别来进行物种鉴别的技术［10-11］。区别于传统的物种监测技术，DNA条形码技术更加快捷、准确以及对操作者要求更低，因此该技术在物种鉴别方面得到了广泛的应用。

虽然DNA条形码技术提供了一种新的物种鉴定技术手段，但也存在着比较大的局限性：首先DNA条形码技术是利用完整的DNA来进行单个物种鉴定，这是耗时且在某些情况下困难的；其次DNA条形码在操作过程中也会出现DNA降解等问题，导致测试结果准确度降低［12-13］。随着高通量测序技术不断发展，诞生出了可以快速进行生物多样性监测的环境DNA宏条形码技术，在降低监测工作量的基础上，提升了监测效率。例如，在湖泊中要检测到相同数量的鱼类，使用88个刺网需要3 d，而使用环境DNA宏条形码只需要4 h；对于地中海池塘中两栖动物的检测，为获得与单一环境DNA宏条形码相似的检测结果需要进行4次检测［14］。环境DNA宏条形码技术通过提取水体、土壤、空气中的环境DNA，使用引物进行PCR扩增并高通量测序得到上千至上百万的读数数据，并利用这些数据确定物种存在，进行生物多样性评估［15］。

2 环境DNA宏条形码技术的研究方法

环境DNA宏条形码技术操作主要包括：样品采集、DNA提取、PCR扩增、高通量测序、序列对比与物种注释等环节。

2.1 样品采集

环境DNA样本主要来源于水体、土壤以及空气等。样品采集的核心问题是要尽可能的获取并保存目标物的环境DNA。但由于环境DNA的分布会受季节［16］、周围自然环境［17］压力等因素的影响，不同的采样方案与采样方式对不同来源的环境DNA有着不同的收集能力［18］。因此不同特征的环境类型需要设计针对性的采样方案。对于流动水体，例如溪流，由于其具有混合良好的湍流，因此表层水即可用于环境DNA检测［19］；对于类似湖泊这样的静止系统，沿河岸线进行采样可以捕获大多数的环境DNA［18］。目前各环境中样品采集还没有统一采样标准，例如空气环境微生物采集可以采取惯性撞击类、过滤阻留类、静电沉着类和温差迫降类等多种方法［20］。这些方法各有利弊，需根据研究目的选择合适的采样方法。

采样之后要对环境DNA进行保存，有研究证明环境DNA降解速度很快，一般在48 h内超出检测范围，同时在野外条件下环境DNA的降解速度将更快［21］。但在低温［22］、低 UV-B［23］、碱性［24］条件下环境DNA分解速度较慢。因此在采样结束后通常加入乙醇或Longmire缓冲液，前者通过使细菌细胞脱水和蛋白质变性来保存环境DNA；后者利用EDTA与SDS抑制酶活性、叠氮化钠抑制细菌生长［25］。近年也有学者提出用丙二醇防冻剂代替乙醇，可以绕过漫长的蒸发步骤，离心后的样品可以直接、迅速地提取出DNA样品，以避免在处理样本过程中抑制DNA提取或PCR扩增［26］。最后将样品保存于-20℃的冰箱待测。

2.2 DNA提取

有研究对水样中环境DNA的提取进行了统计分析，除少部分实验使用溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、酚-氯仿-异戊醇（PCI）或高盐法提取环境DNA，大多数研究采用DNA提取试剂盒进行环境DNA提取［27］。DNA提取试剂盒是依照氯化苄法所构造的，让核酸溶于特定溶液中，使其在固相介质内部相互吸附并洗涤去除杂质，通过变更溶液环境使DNA能够在TE缓冲液或纯水中溶解［28］。

土壤DNA提取的主要方法有SDS高盐提取法、裂解酶法、TENS法与试剂盒法等。但与其他环境中的DNA提取不同，土壤中含有大量的腐殖酸类物质，这些物质在提取过程中无法被去除，基因组中残留的腐殖酸类物质会抑制Tap聚合酶活性，进而降低PCR扩增的准确性，需要进行DNA纯化［29］。由于试剂盒法兼顾DNA的提取与纯化，因此在土壤环境DNA宏条形码中使用最为广泛。

空气环境DNA提取同水体、土壤类似，主要使用DNA提取盒。研究证明不同的试剂盒会影响细菌［30］、花粉［31］模拟群落的组成和数量，而对真菌［32］没有影响。溶解细胞提取DNA时，由于花粉外壁层具有高度结构完整性，而真菌对细胞壁有抗性，无效的细胞破坏只能增加脆弱单核细胞的DNA提取量，而不是增加抗性细胞的DNA提取量，所以需根据实际设计一种有效方法最大限度的提高DNA产量［33］。

2.3 PCR扩增

聚合酶链式反应（PCR）是一种体外核酸扩增技术，用于放大与扩增特定的DNA片段，因此PCR扩增的第一步就是确定要扩增的DNA片段。在理想情况下，DNA片段应该满足如下的标准：（1）特异性：同一物种中DNA片段需几乎相同，不同物种之间不同；（2）一致性：该DNA片段需标准化，同一片段可以应用于不同的分类群中；（3）稳定性：标记需具有稳定的引物结合位点，允许其在大量的群体中进行扩增和测序［34］。尽管科学家多年来一直在各分类单元中寻找共同的DNA条形码，但为所有物种找到共同的条形码是不可能的，动物、植物、微生物在PCR扩增过程中有着相应的DNA条形码。

Hebert等［10］于2003年首先将线粒体基因细胞色素C氧化酶第一亚基（COI）基因片段用作动物的DNA条形码扩增区域。从此扩增线粒体COI基因作为研究动物的DNA条形码得到了广泛的应用。但随着研究的深入，单一基因序列导致物种分辨率不足的问题逐渐引起了人们的重视，COI基因在两栖爬行类种内歧化程度高，PCR扩增过程中会使种间与种内遗传距离发生重叠现象［35］。且相比于单个DNA条形码，多种DNA条形码联用可以提高物种检出率［36］。目前动物DNA条形码的研究多采用COI基因，Cyt b 基因，18S rDNA 和 12S rRNA 等［37-39］。

由于植物的线粒体基因遗传变异较慢、遗传分化较小，导致COI种间差异较小，不适用于植物的DNA条形码扩增，而4个编码基因区（matK、rbcL、rpoB和rpoC1）与3个非编码间隔基因（atpF-atpH、trnH-psbA和psbK-psbI）都是可以用于植物DNA条形码扩增的区域［40］。2009年国际生命条形码植物工作组从普遍性、序列质量和物种鉴别水平评价的基础上将植物叶绿体中的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基（rubisco large subunit，rbcL）和trnK基因中的成熟酶编码（maturase K，matK）作为植物的标准DNA条形码片段［40］。此外，在实际运用中核糖体基因内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）也得到了广泛的使用［41］。

微生物DNA条形码研究主要集中于真菌，经过各国真菌学家对不同真菌类群的不同基因序列研究筛选过后，于第四届国际生命条形码大会确定了ITS作为真菌的首选DNA条形码，这是由于其是当前真菌物种鉴别能力最高的单一DNA片段，分辨率可达72%，并且大小合适，扩增成功率高［42］。

2.4 高通量测序

传统的测序方法是由Sanger等于1977年发明的双脱氧核苷酸末端终止法，但其只能对样本进行单独测序，不宜处理复杂的环境样本［43］。直到2005年，出现了可以在大量环境样本中恢复DNA序列，同时从多个模板读取DNA的第二代高通量测序技术，相比于第一代测序技术速度更快，成本更低［44］。

2.5 序列对比与物种注释

DNA宏条形码技术的生物信息学分析包含5个核心步骤，即样品分解、合并双端测序读数、质量过滤、OTU管理和分配物种注释。宏条形码技术为了最有效的利用测序平台的高容量流通池，通常将许多样品复用合并到单个测序文库中，首先使用测序适配器中的独特寡核苷酸索引将序列分配回原始样本［45］。之后需要将测序适配器与PCR引物等非生物信息移除，串联重复序列，但在数十亿碱基的情况下难免会产生错误［46］。质量过滤就是降低噪音，即去除低质量、嵌合体以及短于150 bp等的噪音序列。质量过滤时的参数非常重要，序列质量过滤严格可消除错误读数，维持正确的生物多样性与物种丰度估计，但过于严格的参数会删除过多的读数，导致低丰度的物种难以监测，不利于入侵物种的早期检测，产生假阴性的错误，通常最佳参数一般取决于研究目标［47］。之后这些序列将会集中于一个指定的相似性阈值范围内（通常为97%），形成一个操作分类单元（OTU），利用BLAST等工具查询序列与参考数据库中相似性最高的序列分类进行对比分析，分配物种注释。

3 环境DNA宏条形码技术的应用

环境DNA宏条形码其快捷、准确以及对自然环境破坏小的特点，扩大了生物多样性的研究范围，让更多的科研人员进行生物多样性研究与监测，在水体［38，48-50］、陆地［51-53］、空气［54-56］环境中得到了广泛的应用（图1）。目前该技术已用于新西兰生物安全和农业的政府监测项目［6］，欧洲标准委员会也将DNAqua-Net作为其一个常设工作组［57］。

图1 环境DNA宏条形码技术在水体、土壤、空气中的应用流程Fig.1 Application process of environmental DNA macrobarcoding technology in water，soil and air

3.1 水环境

水环境是环境DNA宏条形码技术运用最广泛、最成熟的领域。早期研究集中于环境DNA宏条形码技术与传统调查方法的比较，发现无论是淡水环境还是海洋，环境DNA宏条形码技术监测结果更加准确，操作相对便捷，对物种与栖息地的干扰也更小［37，39，58-59］。Ortega 等［60］在研究大型水生植物对海岸沉积物碳汇的贡献率时，对比了环境DNA宏条形码技术与传统的稳定同位素方法，调查表明环境DNA宏条形码技术与稳定同位素在大型植物碳汇贡献方面结果相似，但在区分海洋大型植物类群方面具有明显优势。Rivera等［61］使用海龟壳上的附生硅藻生物膜来推断海龟的行为，发现相对于传统监测方法，环境DNA宏条形码技术不仅可以应用于生态系统监测，也可应用于监测大型脊椎动物的活动行为。

水环境中的环境DNA宏条形码研究主要是通过水样、生物样本、沉积物这3种方式。水样采集是水环境中环境DNA宏条形码测试最常见的方法。正是水体中环境DNA的快速降解的特性，使其在濒危物种保护与监测入侵物种方面非常有用，因为阳性检测与当前存在的物种与种群有关，而过去存在物种的环境DNA将不会被发现。目前被用于监测濒危的巴西青蛙（Hylodes）［62］、鳗鲡［63］，与入侵物种亚洲鲤鱼［64］、克氏原螯虾［65］等。利用环境DNA宏条形码技术，部分地区建立了快速有效和环境友好的监测方案，为生态保护政策的制定提供了科学依据。

除了采集水样，还可通过直接采集生物样本与生物膜，并将其分类混合，从混合物中提取环境DNA进行研究。Chain等［49］用大量浮游动物样本鉴定了加拿大海岸线和五大湖沿岸的海洋和淡水港口约400个后生动物科的生物，其中30种之前从未被报道过。Sohlberg等［50］对地下296 m-798 m的地下水中的真菌群落进行了探索，发现所有深度下均有真菌存在，且多样性高于预期。环境DNA宏条形码技术提高了分类学分辨率，产生了更多对已鉴定物种的检测结果。该技术通过生物样本可以表征任何规模生物体的复杂群落，并且可使用多个引物实现最佳监测覆盖范围。

相较水样和生物样本而言，沉积物多被作为古代DNA的主要来源，研究过去的生态环境与生物多样性［66-67］，且可追溯至 12.6 万年以前［68］。相比于通过花粉与化石研究古代生态系统的传统方法更加省时省力、准确。这些对过去生态系统的研究在制定未来保护规划、建立气候变化模型，以及评估生物多样性的人为影响等方面具有重要作用［15］。同时环境DNA宏条形码技术的运用，使得之前传统方法调查非常困难的海洋沉积物变得简单了起来［69］，且在生物多样性评价中有着巨大的潜力［70-71］。

如今该技术被用来研究环境中的物种和群落结构，进而评价环境质量与健康状况。例如通过研究真核生物和细菌指示类群的变化研究河口与沿海环境的营养负荷［72］；通过分析细菌、原生生物和后生动物的群落演替，研究河北石油公司溢油事故对沿海生态系统造成的长期的生态影响［73］；通过监测浮游植物的生物多样性与完整性指数，综合评价太湖水生生态系统的环境质量与健康［74］等。这些研究工作提供了一个全面的、标准化的方法，能够以更快的时间和更低的成本进行生态系统健康评估。

3.2 土壤环境

土壤环境DNA宏条形码起始于2009年，Buée等［75］利用土壤样本评估了6种不同森林土壤中真菌的丰度与多样性，结果均高于预设，展现出了环境DNA宏条形码技术在土壤环境中良好的研究前景。

陆地的环境DNA宏条形码技术研究可以通过土壤、根系、生物样本等方式，但主要都集中在生物频繁接触的土壤样本上［15］。Bienert等［51］通过环境DNA宏条形码技术设计2个特异性引物（约30 bp和70 bp），对法国阿尔卑斯山发现的14种蚯蚓建立了线粒体DNA（mtDNA）16S基因的参考数据库，可以更容易地从土壤样本中识别出蚯蚓的种类。Andersen等［76］利用丹麦野生动物园、动物园和农场的全pH范围［（6.2-8.3）±0.2］的土壤样本监测脊椎动物生物多样性，为传统的生物多样性调查提供了一种快速的替代方法。

植物根系研究中最困难的环节是对不同植物根系的精准识别［77］。随着高通量技术发展，环境DNA宏条形码技术被用于植物根系研究。Lamb等［78］对trnL引物进行了修改，成功对温带草原与北极苔原生态的根系样本进行了识别。根系也在构建微生物群落中起着重要作用，Khaliq等［79］分别通过传统方法与环境DNA宏条形码技术监测疫霉菌，结果在检测到的30个疫霉菌系统类型中只有7个是通过传统方法检测到的，研究表明根系是检测疫霉菌群落的最佳样本。这些研究均体现了环境DNA宏条形码技术巨大的应用潜力，不仅为土壤根系研究提供了新方法，也为进一步研究植物根系的生态功能开启了新视角。

土壤环境中，环境DNA宏条形码技术也可利用生物样本进行研究。Horton等［52］结合COI基因与核糖体18S rRNA基因设计引物分析无脊椎动物样本，成功鉴定了马尼斯蒂国家森林无脊椎动物的生物多样性。Singer等［80］利用18S rRNA的V9区域，通过凋落物或苔藓样本调查高山环境中顶复动物亚门的生物多样性，进而推导生态系统中后生动物尤其是无脊椎动物的生物多样性。该研究也表明基于环境DNA宏条形码技术推断寄主-寄生物关系，是一种探索未知类群多样性、推断潜在寄主-寄生物或其他生物相互作用的有效方法。推导寄主-寄生物和群落的评估，正是一个对生物多样性监测至关重要，且很难用传统方法辨别的研究领域［15］。

在土壤环境的生态监测中特别值得关注的是环境DNA宏条形码技术的一种独特的监测方法，利用该方法可以通过监测某种生物间接对其他生物进行监测，可监测一些隐蔽与稀有的物种，结果可靠的同时成本也十分低廉。例如Schnell等［81］通过水蛭所吸食的血液在越南热带雨林环境中探索了哺乳动物的生物多样性，并发现了5种新的哺乳动物。Calvignac等［53］将腐肉蝇的源DNA作为一种工具，对哺乳动物生物多样性进行全面、经济且有效的评估。Thomsen等［82］通过对野生花卉进行监测来调查陆生节肢动物，发现这些节肢动物来自67个科和14个目。如果没有环境DNA宏条形码技术，这样的监测是不可实现的。

土壤环境中环境DNA宏条形码技术也可通过监测环境中的物种与群落结构，综合评价环境质量与健康状况。Yan等［83］利用环境DNA宏条形码技术对土壤里的真菌进行定量监测分析，研究真菌对生态系统恢复的反应，监测土壤恢复效果，强调环境DNA宏条形码技术是一种非常有用的恢复监测工具。Wangensteen等［84］利用多基因（18S和COI）分析3种入侵海藻增殖对西班牙国家公园沿海岩石群落的影响，并制定保护区的管理计划用来防止或抵消它们的影响。众多研究表明，相对于传统技术，环境DNA宏条形码技术在污染反应研究中显得更加敏感［85-87］。

3.3 空气环境

传统空气生物学主要依靠培养基和显微镜评估生物多样性与物种丰度。而环境DNA宏条形码是一种无需培养的方法，可以检测出不能在体外培养以及死亡或休眠的微生物［88］。因此提供了对空气中微生物进一步监测、评估、比较和分类的可能性。

空气中环境DNA宏条形码主要研究通过空气传播导致人与动物过敏甚至感染的物质，例如花粉和病原体等，近年多用于监测城市屋顶和田间中捕获的孢子样本的组成［54-55，89-90］。Yamamoto 等［54］以植物病原微生物为研究对象，在美国康涅狄格州纽黑文一座5层建筑的屋顶上进行了4个不同季节的空气采样，首次对空气中真菌的组成进行了研究，发现大气中真菌多样性比以往报道的要高，可与土壤环境的真菌多样性相媲美，同时证明了环境DNA宏条形码技术在大气真菌生态学中的巨大潜力。Kraaijeveld等［56］研究了空气中花粉粒的种类组成，他们在荷兰莱顿大学医学中心主楼屋顶通过Burkard空气颗粒采样器收集空气中的花粉，分别使用显微镜与环境DNA宏条形码技术对花粉进行鉴定与定量分析，结果表明环境DNA宏条形码技术比显微镜更易识别出致人过敏的植物花粉的来源，并且随着该技术的进一步发展，会允许更长的trnL片段被测序，将进一步提高分辨率与降低成本。

虽然大部分空气环境的环境DNA宏条形码研究发生在自然环境中，但该方法也可以用于室内环境，特别是类似于垃圾处理厂［91］、农舍［92-93］这些工人每天接触生物气溶胶的场所，以及医院［94］这种人口密集、空气中存在大量致病微生物的地方。Tong等［94］就利用传统培养基法和环境DNA宏条形码方法对医院空气中的微生物多样性进行了研究，测定了真菌、古菌、细菌和病毒的相对丰度，发现与传统培养基法一次只能鉴定少量病原体不同，环境DNA宏条形码技术可以提供医院环境中空气传播的微生物的完整分布情况。公共卫生机构也常通过空气中微生物群落结构对室内的空气质量进行监测和管理，尤其是大学教学楼与儿童福利机构［33］。Korpelainen等［95］对室内导致人与动物过敏的花粉多样性与季节关系进行了研究，在冬季与夏季都发现了其具有较高的多样性。Coombs等［96］检测了美国绿色环保房屋与非绿色环保房屋中空气真菌的多样性，结果显示绿色环保并不改变室内真菌群落。相信随着高通量技术的发展，环境DNA宏条形码技术与其他互补方法的整合，必将提高空气生物学研究的质量和水平。

4 问题与展望

环境DNA宏条形码技术作为一种快捷、准确且对环境干扰小的物种监测方法已经受到了生态学家的广泛应用，虽然仍然存在着一些技术与应用上的挑战，但随着环境DNA宏条形码技术进一步发展，该技术有望成为一种标准的工具［97］。

4.1 采样方案

样品采集是进行环境DNA宏条形码研究的第一步，也是最易受影响的一步。环境DNA的有效性会随季节变化［16］，分布会受到周围自然环境的限制［17］。不同的采样方案也对不同来源的eDNA有着不同的收集能力，空间采样设计深刻影响eDNA检测，无论是定性还是定量［18］。因此我们要在采用中加入试点研究和适应性抽样，进一步探究环境条件如何影响环境DNA对物种的检测，并根据当地环境因地制宜的设计采样方案。

4.2 偏向性

在进行PCR扩增过程中会产生偏向性［98］，出现未能监测到当前存在的生物类群（假阴性），以及对缺失生物类群的错误观察（假阳性）等问题［99］，使物种检测结果准确度降低，对生物多样性与物种丰富度产生错误的评估。建议对eDNA样本进行优化分析，以严格监测污染，提高检测概率；增加PCR复制次数并将其合并，降低出现假阴性的风险［63］。使用过滤筒和注射器的现场过滤方法也可减少产生假阴性错误，因为这种方法将获得更完整的eDNA［100］。此外，牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies）于2014年推出的纳米孔测序，被广泛认为是“真正的”第三代测序技术（thirdgeneration sequencing，TGS）［101］。相比于第二代测序技术，第三代测序技术无需进行PCR扩增，可解决PCR扩增偏向性等问题。所以今后要大力发展第三代测序技术，并将环境DNA宏条形码技术与之结合。

4.3 DNA条形码数据库

在目标序列对比分析时，环境DNA宏条形码技术需要一个高质量、高准确度的参考数据库。许多研究证明数据库的错误或缺失，都会导致调查结果准确度的下降［102-105］。而构建这样一个高质量、高准确度的数据库是一项非常艰难的任务。此外，在全球范围内对一个大规模的参考数据库进行对比分析可能需要很长的时间［106］。因此今后要不断的去丰富并完善DNA条形码数据库，提高其准确度与可信度。

4.4 从定性到定量

对于目标生物定量研究一直是环境DNA宏条形码技术所面临的主要挑战［5］，自然环境中的生物与非生物因素都会影响环境DNA的来源与降解。尽管有研究在小规模上对目标生物进行了定量与半定量研究［107-109］，在大尺度上仍不适用［110］。但这些半定量研究也为我们提供了一种思路，若生物周围环境DNA的分布规模随降解力的变化而变化，那么参数化影响过程将是环境DNA宏条形码技术定量研究的关键［111］。也有研究建议使用存在-缺失作为物种相对丰度的度量标准［112］。目前利用环境DNA宏条形码技术进行定量研究仍有着巨大的挑战性。

4.5 从研究到应用

要将环境DNA宏条形码技术长期用于生态环境监测，其成本是一个重要的考虑因素。尽管某些情况下多物种环境DNA宏条形码技术可以通过评估目标物种数量来弥补高成本这一缺点，但对于单个样本的测序研究，其成本将大大高于传统的定量PCR方法（qPCR、ddPCR）［113］。此外，若让公众参与到环境DNA宏条形码技术的调查中，需要更多“用户友好”型的样本收集与数据探索方法［97］。随着大数据、云计算和人工智能等领域的快速发展，可将环境DNA宏条形码技术与机器学习、卫星遥感等跨学科相结合，形成智能化的生态监测与全球化的监测网络［114］，使环境DNA宏条形码技术向下兼容，得到更为广泛的应用。