林麝干扰素α基因克隆、表达及转录调控分析

杨威 伍茜 程建国 罗燕 王印 杨泽晓 姚学萍

（1. 四川农业大学动物医学院，成都 611130；2. 四川养麝研究所，成都 611800）

林麝（forest musk deer，FMD）已列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅱ，也是我国一级保护动物，其雄性分泌的麝香为名贵的中药材和高级动物香料，具有重要的社会价值和经济价值［1-2］。由于生态环境的破坏及过度的捕杀，野麝资源濒临灭绝，麝香资源濒于枯竭。由于麝资源匮乏和麝香在国内外市场供不应求的矛盾，人工养麝前景十分广阔。国际国内保护条例规定只有人工养麝获取的麝香才允许进行合法的国际国内贸易［3］。但是目前对麝的一些疾病发生机制不甚了解，病原体的检测技术不够成熟，防治手段过于有限，林麝病症不易外显等原因，导致人工养殖林麝繁殖成活率偏低、群体死亡率高。目前，关于林麝疾病的研究报道中，除了研究较多的各类细菌导致的疾病外，也有林麝感染病毒死亡的相关报道［4］。因此，对林麝病毒性疾病的防治对林麝人工养殖产业的发展意义重大。

自1957年干扰素（interferon，IFN）被发现后的半世纪以来，干扰素一直是病毒学、细胞学、分子生物学、免疫学等相关领域的研究热点。干扰素的生物学活性具有相对种属特异性，即某一种属动物产生的IFN只能对同种属或种属非常接近的动物有保护力。同时，干扰素的抗病毒作用是广谱的［5］。干扰素是通过刺激机体自身抗病毒蛋白的表达来提升机体对病毒的抵抗作用从而达到抗病毒目的［6］。因此，干扰素在病毒性疾病的防治上，具有广阔的前景。

近年来，随着干扰素在一些畜禽病毒性疾病及肿瘤性疾病的治疗方面取得良好疗效，兽医科研工作者愈加重视干扰素在动物体内的免疫特性及其临床制品的研究，大熊猫、狐狸、水貂、貉等越来越多动物的IFN基因相继被研究报道，动物基因工程干扰素的应用也会越来越广泛［7-9］。林麝干扰素具有很高的临床应用前景，研究林麝干扰素对林麝病毒性疾病的防治有重大意义。因此，本研究对林麝干扰素α进行了克隆与生物信息学分析，利用毕赤酵母表达系统对林麝干扰素α进行了外源表达，并对林麝干扰素α抗增殖作用和刺激抗病毒蛋白转录作用进行了研究，为林麝干扰素α的应用提供相关理论基础，也为林麝病毒性疾病的防治提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

林麝血液采集于四川养麝研究所。毕赤酵母X33、表达载体pPICZα A、林麝肺脏成纤维细胞FMD-C1由四川农业大学动物检疫实验室保存。大肠杆菌DH5α购自天根生化科技有限公司；pMD19-T载体和T4连接酶购自大连宝日医生物技术有限公司；2×Pfu PCR Mix、2×Taq PCR MasterMix和DNA分子质量标准购自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取试剂盒购于成都福际生物技术有限公司；cDNA合成试剂盒和DNA凝胶回收纯化试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、预染蛋白分子量标准、CCK-8、小鼠抗6×His单克隆抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG单克隆抗体和DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；质粒DNA小量抽提试剂盒和SYBR Green 染料法Mix购自生工生物工程（上海）股份有限公司。快速内切酶EcoR I、Not I和Sac I均购自莫纳生物科技有限公司。氨苄青霉素、Zeocin、超滤离心管和酵母基因组提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。澳洲胎牛血清和DMEM培养基购自美国Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 根据有关动物保护法，于林麝外周静脉取血，枸橼酸-枸橼酸盐-葡萄糖（ACD）抗凝，淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞（PBMC），PBMC在1 μg/mL的刀豆蛋白A（ConA）诱导下37℃培养48 h后，按照RNA提取试剂盒说明，提取细胞总RNA，利用cDNA合成试剂盒合成cDNA，存于-70℃超低温冰箱中。

1.2.2 引物设计与基因克隆 根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库已上传的林麝近亲物种牛、绵羊、山羊等IFN-α的核苷酸序列与林麝已上传的基因组数据，设计克隆林麝IFN-α（FMD-IFNα）基因的引物与干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的特异引物。本试验检测的林麝ISG为2′-5′-寡腺苷酸合成酶（2′-5′-oligoadenylate synthase，OAS）、病毒抑制蛋白Viperin（VIP）、黏病毒抵抗蛋白1（myxovirus resistance 1，Mx1）、干扰素刺激基 因 15（interferon-stimulated gene 15，ISG15） 和干扰素刺激基因56（interferon-stimulated gene 56，ISG56），并以β-actin为内参基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，本试验所用引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

以林麝外周血淋巴细胞cDNA为模板，IFN-α F/R为引物，进行PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。DNA凝胶回收纯化试剂盒回收目的基因片段，并与pMD19-T载体进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5α。以IFN-α F/R及M13 F/R为引物对鉴定转化子，阳性转化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 林麝IFN-α的生物信息学分析 测序结果信号峰图使用Snapgene软件校对，用DNAStar分析软件分析比较，与GenBank公开的其他物种IFNα的基因序列进行同源性分析。运用ExPASy的ProtParam软件分析FMD-IFNα蛋白编码氨基酸的理化性质、MEGA 7.0软件构建系统进化树、NCBI中BLAST在线分析蛋白质保守结构域、SignalP 5.0 Server软件分析信号肽预测及跨膜区、PSIPRED程序预测蛋白质二级结构、SWISS-MODEL软件预测三级结构。

1.2.4 重组毕赤酵母pPICZα-IFNα-X33的构建 复苏测序结果阳性的大肠杆菌，使用质粒DNA小量抽提试剂盒提取pMD19-T-IFNα质粒。将pMD19-TIFNα质粒作为模板，以ExIFNα-F/R为引物，进行PCR扩增，获得表达片段。将表达片段和pPICZα A使用内切酶EcoR I和Not I双酶切，酶切产物分别进行胶回收纯化。使用T4连接酶连接FMD-IFNα表达片段与pPICZα A，构建表达载体pPICZα-IFNα，并转化DH5α。用含有20 μg/mL Zeocin抗生素的 LB固体培养基筛选阳性转化子。分别以ExIFNα-F/R和AOX I-F/R为引物，对生长出来的单个菌落进行PCR鉴定并送测序。

扩大培养阳性转化子并提取pPICZα-IFNα质粒，并使用内切酶Sac I将其线性化。按照文献［10］的方法制备毕赤酵母感受态，将线性化后的pPICZα-IFNα与毕赤酵母感受态混合，使用电转仪进行电转化。以 YPD 平板（100 μg/mL Zeocin）于 30℃培养酵母转化子，并提取酵母转化子基因组DNA。以转化子DNA为模板，ExIFNα-F/R和AOX I-F/R为引物，对转化子进行PCR鉴定并测序。

1.2.5 FMD-IFNα蛋白的诱导表达 将阳性重组子接种于BMGY培养基中，在30℃条件下220 r/min培养至OD600达到2.0-6.0，离心收集菌体，使用适量体积BMMY培养基重悬菌体沉淀，在30℃，220 r/min条件继续培养，每24 h向培养基添加甲醇至终浓度为1%，诱导表达72 h。诱导结束的培养基离心取上清液，使用超滤离心管对上清液进行浓缩。取浓缩的上清液进行SDS-PAGE、Western blot分析，具体方法参考［11］。成功表达目的蛋白的阳性酵母重组子进行诱导表达甲醇浓度优化和诱导时间优化。甲醇浓度优化为阳性重组子于0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的甲醇浓度下，诱导表达72 h后取样进行SDS-PAGE检测。表达时间优化为阳性重组子于1.0%的甲醇诱导浓度下，在诱导24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后取样进行SDS-PAGE检测。使用Ni-NTA蛋白纯化试剂盒纯化FMD-IFNα，并使用超滤管浓缩除盐，用于后续试验。

1.2.6 林麝IFN-α刺激林麝肺成纤维细胞FMD-C1 以10%胎牛血清浓度的DMEM培养基，37℃，5% CO培养FMD-C1细胞。将5×105个/mL，

22 mL/孔的FMD-C1细胞接种于12孔板中，待细胞长满孔底的80%时，加入FMD-IFNα刺激细胞。剂量依赖性检测：加入细胞培养液中的FMD-IFNα终浓度分别为400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL和50 ng/mL，以不加FMD-IFNα孔作为对照，孵育12 h，提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，-20℃保存。时间依赖性检测：细胞培养液中加入400 ng/mL的FMD-IFNα，并分别于培养6 h、12 h、18 h和24 h后，提取细胞总RNA，以未加入FMD-IFNα孔作为对照进行后续试验。

1.2.7 qPCR检测林麝IFN-α对细胞内抗病毒基因表达影响 以FMD-C1 cDNA为模板，ISG（OAS、Viperin、Mx1、ISG15和ISG56）和β-actin引物对为引物进行PCR获得目的片段，并连接pMD-19T构建重组质粒。使用重组质粒制备标准品，并以其为模板进行qPCR，建立标准曲线与溶解曲线，计算引物的扩增效率（Efficiency）与相关系数（r2）。再使用ISG与β-actin-F/R为引物，FMD-C1 cDNA为模板进行qPCR，检测各个样本中相关基因的Ct值，以Pfaffle法［12］进行转录水平计算。Pfaffle法计算公式为：

1.2.8 林麝IFN-α对林麝肺成纤维细胞FMD-C1的增殖抑制检测 以 1×105个 /mL，100 μL/孔的FMD-C1细胞浓度接种于96孔板，于37℃，5% CO2培养24 h后，分别加入至终浓度为400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL和 50 ng/mL的 FMD-IFNα，以不加FMD-IFNα孔作为对照，每组设置5个复孔。孵育24 h后，每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1.5 h，使用酶标仪测量每孔450 nm吸光度，使用600 nm的波长为参比波长，并计算细胞生长抑制率。计算公式为：细胞生长抑制率/%=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100。

2 结果

2.1 FMD-IFNα基因序列的扩增与克隆

林麝外周血淋巴细胞cDNA为模板，IFN-α F/R为引物，PCR扩增获得约570 bp特异片段（图1-A）。构建重组质粒pMD19-T-FMD-IFNα经M13-F/RPCR扩增获得680 bp特异片段，符合试验预期（图1-B）。

图1 FMD-IFNα的克隆及鉴定Fig. 1 Cloning and identification of FMD-IFNα

2.2 FMD-IFNα基因序列比对

通过对阳性克隆子测序，本次实验获得9种FMD-IFNα亚 型， 分 别 命 名 为 FMD-IFNα1-FMD-IFNα9，基因序列均为570 bp，编码189个氨基酸。9种FMD-IFNα亚型的序列已上传NCBI数据库，登录号为MW394230-MW394238。9种FMD-IFNα的氨基酸序列对比图见图2，其中包括了亲缘关系较近的牛（BosIFN-αA），与亲缘关系较远的野猪（SusIFN-α4）和人（HomoIFN-α2）。信号肽预测结果显示，FMDIFN-α前23位氨基酸为信号肽。9种FMD-IFN-α均包含4个半胱氨酸残基，它们位于成熟蛋白序列的1、29、99和139位，可形成两个二硫键，与其他哺乳动物IFN-α中的保守半胱氨酸一致。同时在4、26、39、110和139位含有的5个脯氨酸也与哺乳动物IFN-α 5个保守脯氨酸位点一致。

图2 各亚型FMD-IFNα氨基酸序列同源性Fig. 2 Homology of amino acid sequence of each subtype of FMD-IFNα

9种亚型之间，核酸序列同源性为97.0%-99.6%，氨基酸序列同源性为93.7%-99.5%。FMDIFNα与同为反刍亚目的牛（BosIFN-αA）、山羊（CapraIFN-α）、印度黑羚（CervicapraIFN-α）、绵羊（OvisIFN-α1）的核苷酸同源性均大于94%，氨基酸序列同源性大于88%；与野猪（SusIFN-α4）的核苷酸同源性低于84%，氨基酸同源性低于70.9%；与人（HomoIFN-α2）的核苷酸同源性低于80.2%，氨基酸同源性低于65.4%。

利用MEGA 7.0软件邻近法对林麝、牛、绵羊、山羊、印度羚羊和作为外群物种的人和野猪的IFN-α氨基酸序列进行系统发生树的构建，步长检验为1 000次，结果见图3。由图可知，林麝与绵羊、山羊、牛、印度羚羊共同构成一个主要分支，置信度为100，同时，9种林麝干扰素α再单独形成一支。人和野猪（外群）分别形成一个单独分支。

图3 IFNα氨基酸序列系统发生树Fig. 3 Phylogenetic tree of IFNα amino acid sequence

鉴于9条FMD-IFNα的核苷酸序列与氨基酸序列的高同源性，后续信号肽预测、二级结构预测、三级结构预测结果图均以FMD-IFNα1亚型为代表进行展示。FMD-IFNα信号肽预测结果表明FMD-IFNα的前23个氨基酸为信号肽，成熟蛋白质由166个氨基酸组成。FMD-IFNα理化性质分析结果表明成熟FMD-IFNα蛋白分子质量为18.9 kD，等电点为8.46。二级结构预测结果表明IFN-α成熟蛋白的二级结构由5个主要的α-螺旋和无规则卷曲构成。FMDIFNα的三级结构见图4，与牛、人的干扰素α的三级结构高度相似，均具有5个明显的α-螺旋结构。

图4 干扰素α三级结构对比Fig. 4 Comparison of the tertiary structure of interferon-α

林麝IFNα成熟蛋白保守结构域分析和功能位点预测结果见图5。IFN-α成熟蛋白质第3-162位氨基酸构成一个干扰素α/β结构域；第3-155位氨基酸序列构成 I型干扰素结构域，属于较大的螺旋状细胞因子超家族。氨基酸序列的第5-20位和第77-99位分别包含一个IFNAR-1结合位点，第30-48位和第118-137位分别包含一个IFNAR-2结合位点。第78位氨基酸预测为N -糖基化位点，为保守结构域IFab上的N-糖基化位点。

图5 FMD-IFNα成熟蛋白质的保守结构域预测Fig. 5 Prediction of the conserved domains of FMD-IFNα

2.3 FMD-IFNα的诱导表达

本试验选择FMD-IFNα1亚型进行外源表达及后续试验。以阳性转化子的pMD19-T-IFNα质粒为模板，ExIFNα-F/R为引物进行PCR扩增的结果见图6-A，在约500 bp处有明显条带，符合预期。pPICZα-IFNα的PCR鉴定结果见图6-B，符合预期大小1 044 bp，测序结果也符合预期，表达载体构建成功。

图6 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig. 6 Agarose gel electrophoresis of PCR products

PCR鉴定pPICZα-IFNα电转化的毕赤酵母，结果见图7。以ExIFNα-F/R和AOX1-F/R为引物的PCR产物均符合预期，测序结果正确，重组毕赤酵母pPICZα-IFNα-X33构建成功。

图7 阳性毕赤酵母转化子PCR鉴定结果Fig. 7 PCR identification results of positive Pichia pastoris transformants

pPICZα-IFNα-X33初步诱导表达上清液的SDSPAGE电泳和Western blot均在15-25 kD之间有一明显蛋白条带（图8），符合实验预期。毕赤酵母表达的时间优化和浓度优化结果见图9。结果表明pPICZα-IFNα-X33诱导表达的最佳甲醇浓度为1%，最佳诱导时间为96 h。

图8 FMD-IFNα初步诱导结果Fig. 8 Preliminary expression results of FMD-IFNα

图9 重组毕赤酵母诱导表达优化结果Fig. 9 Recombinant Pichia pastoris induced expression optimization results

2.4 林麝IFN-α对其通路上抗病毒相关基因表达的影响

林麝ISG和β-actin引物的qPCR熔解曲线均呈单一峰，无杂峰，引物特异性良好；OAS、Viperin、Mx1、ISG15、ISG56和 β-actin的 扩 增 效 率 分 别为 103.5%、107.9%、104.1%、100.1%、91.5% 和102.9%，符合qPCR引物要求；r2均大于0.99，具有良好的线性相关性。

FMD-IFNα刺激FMD-C1细胞的剂量依赖性见图10-A。用4种浓度FMD-IFNα刺激FMD-C1细胞12 h后，FMD-C1的ISG转录水平有了较大提升，并且具有较明显的剂量依赖性。Viperin、Mx1和ISG15在200 ng/mL处理组中的表达量显著高于100 ng/mL处理组；400 ng/mL处理组的OAS、ISG15和ISG56表达量显著高于200 ng/mL处理组（P＜0.05）。总体来看，400 ng/mL对FMD-C1的转录调控作用最强。时间依赖性试验结果显示FMD-IFNα对ISG转录的刺激主要集中于前6 h，在后面的18 h里，FMDIFNα对ISG转录的调控效果受到持续的限制，导致ISG mRNA量持续下降，具体结果见图10-B。

图10 FMD-IFNα调控ISG转录结果Fig. 10 Regulation results of FMD-IFNα on ISG transcription

2.5 林麝IFN-α对FMD-C1细胞增殖的抑制作用

使用CCK-8法对FMD-IFNα抑制FMD-C1细胞增殖能力进行了检测，结果见图11。FMD-IFNα对FMD-C1细胞的增殖抑制效果呈现明显的剂量依赖性，100 ng/mL FMD-IFNα对FMD-C1细胞的增殖抑制效果显著高于50 ng/mL FMD-IFNα（P＜0.05）；400 ng/mL FMD-IFNα对FMD-C1细胞的增殖抑制效果显著高于200 ng/mL FMD-IFNα（P＜0.05），细胞增殖抑制率达到了最高的16.67%。

图11 FMD-IFNα对FMD-C1细胞增殖的抑制作用Fig. 11 Inhibitory effect of FMD-IFNα on the proliferation of FMD-C1 cells

3 讨论

随着人工养麝产业的发展，林麝疾病防治研究也在深入进行。目前，林麝粪便中已检测出多种病毒，并且已有林麝感染病毒致死的报道［4，13-14］。因此，林麝病毒性疾病的防治对人工养麝产业的发展具有深远的意义。IFN-α是 I型干扰素的一种，具有多个亚型，是目前研究最多的干扰素，已经广泛应用于多种疾病的治疗，如：各种肝炎、人乳头瘤病毒、水泡性口炎等病毒病［15-17］。研究林麝IFN-α对于林麝病毒性疾病的防治具有长远的意义。

本次试验克隆的9种FMD-IFNα亚型的核苷酸序列具有高度同源性；信号肽组成与反刍类物种IFN-α相一致；半胱氨酸与脯氨酸位点均与已知哺乳动物 IFN-α一致［18-21］。FMD-IFNα的二级结构由紧密排列的α-螺旋结构域构成，这是 I型IFN都具有的相似的结构。FMD-IFNα的三级结构与牛和人IFNα高度相似。结构域预测结果表明FMD-IFNα可以与IFN-α受体（IFNAR-1和IFNAR-2）结合。IFNAR-1与IFNAR-2是干扰素生物活性至关重要的受体。系统发生树显示了FMD-IFNα与反刍亚目物种的近属关系，同时9种FMD-IFNα单独聚为一支，表现出一定的种属特异性。为进一步研究FMD-IFNα的活性，本次试验使用毕赤酵母表达体系完成了对FMD-IFNα的表达。

IFN-α具有强大的抗病毒作用，这个作用是通过调节数量庞大的IFN刺激基因（ISG）来实现的。ISG编码的众多蛋白质可以在细胞内建立起对病毒的广谱抵抗状态［22］。本次试验检测了FMD-C1细胞5个ISG（OAS、Viperin、Mx1、ISG15和ISG56）转录水平的变化。OAS可以抑制病毒蛋白合成及病毒复制；Viperin能够抑制病毒的出芽及释放；Mx1可以抑制病毒核酸进入胞内；ISG15通过将靶蛋白ISG化修饰来调节病毒和宿主蛋白的功能，抑制病毒的复制、出芽、释放；ISG56与其他家族蛋白以及数种RNA结合蛋白形成复合体，从而清除病毒［23］。试验结果表明，FMD-IFNα能显著提高FMD-C1细胞5个ISG的转录水平。400 ng/mL FMD-IFNα刺激FMD-C1细胞6 h使Viperin转录水平达到了对照组的近3 000倍，Mx1、ISG15和ISG56的转录水平也是提高了100-300倍。

临床研究表明，IFN治疗期间，ISG的诱导水平差异很大，表达水平通常取决于时间，剂量和细胞类型［24］。大剂量IFN-α作用后，可迅速发生IFN信号传导并激活ISG转录，但ISG mRNA积累量的峰值都是出现在6 h之前，并于6 h之后快速下调［25-26］。本试验结果表明FMD-IFNα上调FMD-C1细胞ISG转录水平作用具有剂量依赖性，并于前6 h时效果最强，与相关报道一致。ISG转录水平的快速下调是由多种机制促成的，除了相关受体的缺失，更主要的机制是产生了信号抑制因子，如：SOCS1、STAT1β 等［27-28］。SOCS1可 与 IFN-α 受 体 IFNAR1结合，从而阻断STAT1的激活；STAT1β是STAT1的另一种剪接变体，可结合DNA但不能激活蛋白质的转录。只要IFN-α存在，就能使受体细胞脱敏持续存在。

据文献报道IFN-α可以抑制成纤维细胞增殖［29-30］。FMD-IFNα也能抑制FMD-C1细胞的增殖，且呈剂量依赖性，与陈君毅等［31］、于宏等［32］研究结果一致。IFN-α抑制细胞增殖是通过调节细胞分裂周期，并诱导部分细胞凋亡实现的［33-34］。IFN-α会抑制细胞由G0/G1期向S期的过渡，并促进G0/G1期细胞的凋亡［35］。目前已知的IFN-α阻滞G0/G1期细胞的机制包括调控p21基因的表达、抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cdk2）活性、降低E2F转录因子与DNA结合活性等［36］。此外，IFN-α会推迟细胞进入G2/M期，延长细胞处于S期的时间［37］。Detjen等［38］研究表明IFN-α延长细胞从S期进入G2/M期的作用与细胞周期蛋白B（Cyclin B）表达的抑制，细胞分裂周期基因2（Cdc2）蛋白活性的降低有关。

4 结论

本研究成功克隆9种林麝IFN-α基因序列，进行了生物信息学分析，并使用毕赤酵母表达系统实现了表达，最后研究了IFN-α对FMD-C1细胞的ISG转录调控作用和抗增殖作用，为进一步研究林麝干扰素α的抗病毒作用和免疫调控作用奠定了基础。