蒺藜苜蓿MtSAG113基因的转化及表达特征分析

李舒文 李殷睿智 董笛 王梦迪 晁跃辉 韩烈保

（北京林业大学草业与草原学院，北京 100083）

MtSAG113基因是在蒺藜苜蓿中被发现的，该基因属于PP2Cc超家族，为叶片发育和衰老时选择性启动基因［7］。在调控植物叶片衰老方面具有一定的作用［8］。MtSAG113基因在植物抗衰老过程中具有高度的特异表达特性，在植物衰老叶片中可驱动IPT（isopentenyl transferase）基因的表达，对内源分裂素含量进行有效调控，在不影响植株正常发育的前提下，达到延缓叶片衰老的目的［9］。实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）具有重复性好、灵敏度高、定量准确和反应迅速等优点，已成为确定基因表达水平的最常用方法［10-11］。

本试验以烟草和蒺藜苜蓿R108叶片为材料，通过农杆菌介导的叶盘法［12］转化烟草，获得具有抗性的转基因植株以及检测蒺藜苜蓿MtSAG113基因在逆境条件和激素诱导下的表达情况，研究MtSAG113基因的特异性表达，并通过亚细胞定位确定该基因位于细胞核内，旨为进一步探究MtSAG113基因的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的烟草和蒺藜苜蓿为实验室种植，将烟草种植于组培瓶中，于无菌环境下培养20 d左右，进行MtSAG113基因的转化及亚细胞定位实验；蒺藜苜蓿R108种植在12 cm的花盆里，放置于人工培养箱中，植株大约培养20 d，然后对蒺藜苜蓿R108叶片进行处理。剩下的植株继续培养至叶片发黄。反转录试剂盒Prime ScriptRTReagent Kit、DNA提取试剂盒（Plant DNA Kit）、RNA提取试剂盒（Plant RNA Kit）购自OMEGA公司。琼脂、NaCl、6-BA、IAA、ABA购买于Sigma公司，MtSAG113基因为实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 MtSAG113 基因转化及处理 取长势健康的烟草叶片，通过农杆菌介导的叶盘法进行浸染转化。将含有MtSAG113质粒的农杆菌震荡培养至OD600=0.6-0.8时低速离心收集沉淀，然后使用MS溶液进行重悬，即可得到侵染液。将烟草叶片剪碎，于侵染液中浸泡10 min，于接种培养基上27℃暗培养3 d，然后将其转移至选择培养基培养，待系带培养3次后进行诱芽和诱根培养，期间用草铵膦对转化的叶片进行筛选。取生长至60 d左右的成熟蒺藜苜蓿和叶片变黄的衰老蒺藜苜蓿叶片进行荧光定量，检测MtSAG113基因在成熟和衰老叶片的表达量。选取生长状况良好且一致的蒺藜苜蓿R108叶片，分别浸泡于清水、含有15%的聚乙二醇（PEG）溶液、150 mmol/L NaCl营养液、1 μmol/L 6-BA溶液、1 μmol/L IAA溶液、1 μmol/L ABA溶液中，处理时间为 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h。按照DNA和RNA提取试剂盒的方法对所处理的叶片进行DNA和RNA的提取，按照反转录试剂盒的方法进行反转录，最后进行荧光定量PCR检测。选取长势良好的烟草，并将携带35S-MtSAG113-YFP质粒的EHA105农杆菌注射于该烟草中，黑暗培养48 h，在聚焦显微镜下观察YFP信号在细胞中的位置。

对于本论文的探讨方案和方法已经到此为止了，个人认为最后的结果还是有些差强人意，毕竟处理设计与人们的微妙关系不是那么容易做到的，对于不同的客户，设计也有着不同的定向趋势。相信设计在满足其客户的需求同时，满足了好设计的基本概念，就可以在更大程度上满足更多人的需求。

1.2.2 MtSAG113基因在激素诱导后的表达分析 植物外源激素已被研究证实可以参与植物非生物调节，在植物抗逆方面也有良好的调控作用［13-14］。外源植物激素对植物器官生长发育、养分吸收、光合作用以及抗性生理都有一定的影响。同时外源激素对转基因植物的表达量也会产生一定的影响。对蒺藜苜蓿R108叶片进行激素诱导处理，通过荧光定量PCR检测分析表达量。进一步研究激素诱导对蒺藜苜蓿MtSAG113基因表达量的影响。

1.2.3 生物信息学分析 将MtSAG113基因用NCBI网站进行同源蛋白的查找及蛋白结构域的分析。对亚细胞定位预测通过Cell-PLoc package（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）网站完成。

2 结果

2.1 转基因植株及鉴定

经叶盘法对烟草进行转化，提取再生烟草植株的DNA进行PCR检测。以再生植株的DNA为模板进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳检测，结果（图1）表明，检测的7株再生烟草植株中，有5株的DNA片段符合预期大小，未转化成功的和野生型的烟草条带大小则小于预期条带。

图1 转基因植株PCR检测Fig.1 PCR detection of transgenic plants

提取再生植株的总RNA，反转录成cDNA，以再生植株的cDNA为模板进行RT-PCR检测，取RTPCR产物进行凝胶电泳检测，检测结果（图2）显示，所获得的目的片段符合预期大小，表明MtSAG113基因在烟草中成功表达。

图2 转基因烟草RT-PCR检测Fig.2 RT-PCR detection of transgenic tobacco

2.2 转基因烟草表型

将转基因烟草苗与野生型烟草苗同时放于光照培养箱中培养大约1个月，观察其表型。观察发现，转基因烟草与野生型烟草相比植株明显矮小且叶片出现早衰现象（图3）。

图3 转基因烟草表型Fig.3 Phenotype of transgenic tobacco

2.3 MtSAG113基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达分析

对蒺藜苜蓿成熟叶片和衰老叶片进行荧光定量分析，检测MtSAG113基因在调控叶片衰老进程的作用。结果（图4，图5）表明，MtSAG113基因在衰老叶片中表达水平远远高于未衰老叶片中的表达水平；衰老叶片的基因表达量是未衰老叶片的4.94倍。

图4 MtSAG113基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达分析Fig.4 Expression analysis of MtsAG113 gene in Medicago truncatula leaves

图5 蒺藜苜蓿成熟衰老叶片对比Fig.5 Comparison of mature and senescent leaves of Medicago truncatula

2.4 MtSAG113基因未处理条件下的表达分析

清水处理0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、48 h后，荧光定量PCR检测分析结果（图6）显示，0 h的MtSAG113基因表达量最高，处理4 h时达到最低，是0 h样品的13倍，随着清水处理的时间延长，MtSAG113基因表达量有逐渐增加的趋势，但仍然低于0 h。

图6 蒺藜苜蓿MtSAG113基因未处理条件下的表达分析Fig.6 Expression analysis of MtsAG113 gene in Medicago truncatula under untreated conditions

2.5 MtSAG113基因干旱胁迫表达分析

通过PEG模拟干旱胁迫环境，在胁迫处理的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后进行荧光定量分析，检测MtSAG113基因在模拟干旱胁迫的表达情况。结果（图7）显示，胁迫2 h蒺藜苜蓿MtSAG113基因表达水平有所提高，为未处理的3.18倍；胁迫处理4 h后，MtSAG113基因的表达量大大提高，为对照样品的95.96倍；在胁迫8 h时略有下降，但仍为对照样品的62.41倍；随着时间的延长表达量呈现逐渐增加的趋势，并在24 h达到最大值，与对照处理相比增加了276.48倍。

图7 蒺藜苜蓿MtSAG113基因的干旱胁迫表达Fig.7 Drought-stress expression of MtsAG113 gene in Medicago truncatula

2.6 MtSAG113基因盐胁迫表达分析

作为一种重要的胁迫条件，高盐对于很多基因的表达具有调节作用。通过荧光定量分析MtSAG113基因在盐胁迫处理表达情况，结果（图8）显示经NaCl处理后，MtSAG113基因的表达量与对照相比整体呈现增加的趋势。在2 h后表达量逐渐增加，并在12 h达到高峰，是对照处理的49.96倍。随着时间的延长，表达水平逐渐降低，48 h表达水平有所回落，但与对照相比仍增加了54.4%。

图8 蒺藜苜蓿MtSAG113基因的盐胁迫表达Fig.8 Expression of MtsAG113 gene in Medicago truncatula under salt stress

2.7 细胞分裂素对MtSAG113影响

经6-BA处理后，MtSAG113表达量呈现不同程度的增加，在诱导2 h时，出现缓慢的提高，与未处理样品相比，增加了50.44%；在4 h时表达量达到峰值，是对照样品的917.46倍；在8 h时，略有下降，但与对照相比增加了5.72倍；48 h时表达量为对照的6.47倍（图9）。

图9 6-BA诱导对蒺藜苜蓿MtSAG113基因表达影响Fig.9 Effects of 6-BA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.8 生长素对MtSAG113影响

IAA处理后，MtSAG113基因的表达量与对照相比呈增加的趋势，但增加量的趋势呈现出先升高后降低。如图4所示，2 h后，MtSAG113基因的表达增加量逐渐升高，并在12 h达到高峰，与对照相比增加了15.52倍；24 h后增加量出现了迅速的下降，随着时间的延长，表达水平回落至对照组水平（图 10）。

图10 IAA诱导对蒺藜苜蓿MtSAG113基因表达影响Fig.10 Effects of IAA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.9 ABA对MtSAG113影响

外源施加ABA对植物叶片衰老有促进作用，MtSAG113基因在ABA处理2 h时表达水平稍稍降低，但与对照组相比并不显著；随着诱导时间的推移，表达量逐渐增加，并在8 h达到最大值，是对照组的13.02倍；24和48 h虽然表达量出现下降，但与对照相比，表达量仍分别提高了41.84%和116.41%（图 11）。

图11 ABA诱导对蒺藜苜蓿MtSAG113基因表达影响Fig.11 Effects of ABA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.10 生物信息学分析 MtSAG113基因共852个碱基，编码 284个氨基酸。对MtSAG113保守结构域进行分析可知该基因属于PP2Cc超家族。该超家族的磷酸酶的蛋白结构和推导的催化机理与Ser/Thr磷酸酶的PP1、PP2A、PP2B家族相似，与PP2C没有序列相似性。

2.11 亚细胞定位分析 将含有35S-MtSAG113-YFP质粒的EHA105农杆菌注射于烟草中，黑暗培养48 h，在聚焦显微镜下观察YFP信号在细胞中的位置（图12）。图中红色荧光为细胞核自发荧光，黄色荧光为YFP蛋白所发荧光，亚细胞定位结果表明MtSAG113基因定位于细胞核内，与前期预测结果相同。

图12 亚细胞定位结果Fig.12 Results of subcellular localization

3 讨论

衰老是植物生命活动过程中比较重要的生理生化过程，在植物合成代谢的过程中，叶细胞总RNA下降［15］。有研究表明，即使在适宜的外界环境下，叶片衰老仍然会自发的进行，直到叶片细胞凋亡［16-17］。未处理条件下的叶片随着时间的推移，MtSAG113基因呈现逐渐增加的趋势，表明MtSAG113基因可能对叶片衰老具有积极作用。张兰等［18］曾发现，经过外源激素ABA诱导，编码叶绿素酶的PpCHL1的基因在草地早熟禾叶片中表达活跃加速了叶绿素的降解。在外源施加6-BA、IAA、ABA后基因表达量呈现先升高后降低的趋势，并在48 h达到较低的水平，但都明显高于对照组，比较发现MtSAG113基因的表达量受外源激素的诱导。SAG基因在叶片衰老进程中起重要作用，该基因是衰老过程中表达水平上调的基因，Singh等［19］在研究中发现Os SAG12-2在诱导衰老叶片中表达量明显上升，可负调控诱导细胞死亡，促进水稻衰老。该研究中转MtSAG113基因烟草与野生型相比出现矮小及叶片早衰现象，说明MtSAG113基因对植株的衰老具有一定的促进作用。Chen等［20］发现，高盐胁迫后，钙调蛋白基因SPCAM可诱导甘薯叶片衰老，说明逆境胁迫可诱导某些基因的表达。该研究结果显示干旱胁迫和高盐胁迫处理下的蒺藜苜蓿叶片表达量都高于对照组，而且干旱胁迫下呈现持续增加的趋势。表明逆境胁迫下能够诱导MtSAG113基因的表达。Zhang等［21］研究发现，SAG113基因在拟南芥中的表达量随叶龄的延长而增加，而在突变体中，由于ABA合成代谢受阻，在叶片中的表达变得消极。本研究中外源激素及逆境胁迫对MtSAG113基因的诱导具有积极的作用，对此基因的诱导如何影响叶片发育和衰老，还需要进一步的研究。

该基因在拟南芥中研究较多，在苜蓿中鲜有研究，该基因的功能在蒺藜苜蓿中尚未得到证实。因此，本研究以烟草和蒺藜苜蓿R108叶片为材料，通过叶盘法对烟草进行转化获得具有抗性的转基因植株，荧光定量PCR检测MtSAG113基因在逆境胁迫条件以及外源激素诱导处理下的基因表达量。为后续鉴定MtSAG113基因在蒺藜苜蓿中的功能提供研究基础和参考依据。研究结果表明，PCR检测成功获得5株转基因植株，对转基因成功的植株进行RT-PCR检测，检测证明MtSAG113基因在烟草中能够成功表达。转基因植株和野生型植株相比表现出矮小及叶片早衰的表型；MtSAG113基因在衰老叶片中表达水平远远高于未衰老叶片中的表达水平；未处理叶片中的表达水平随着时间的增加有增加的趋势；干旱胁迫和高盐胁迫处理下的蒺藜苜蓿叶片表达量都高于对照组，而且干旱胁迫下呈现持续增加的趋势，在施加6-BA、IAA、ABA外源激素后发现，MtSAG113基因表达量也高于对照。说明逆境胁迫和外源激素可诱导MtSAG113基因在植物叶片中的表达。

4 结论

在逆境条件和外源激素处理下植物叶片中的MtSAG113基因可被诱导表达。这一结果为MtSAG113 基因在功能鉴定及蒺藜苜蓿中的应用提供了新的思路；另一方面，从分子水平上为通过外部常规手段控制植物衰老提供了旁证，同时也为研究豆科植物提供了理论依据。