遗传性釉质发育不全相关基因FAM83H 突变的初步研究

胡仲琳， 刘伟才

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔修复教研室，上海 200072）

遗传性釉质发育不全（amelogenesis imperfecta，AI）是一组相似疾病的总称，是指在牙齿发育过程中， 由于遗传因素而引起的牙釉质形成或矿化障碍，不伴有其他全身性疾病，可同时伴有前牙开牙合或牙齿敏感症等[1]。根据调查人群的不同，AI 的患病率为1/14 000～1/12 000，是口腔科学领域的遗传性疾病。 AI 发病原因及其致病因素众多，并且临床表现也有很大不同，具有临床异质性和遗传异质性[2]。AI 患者临床表现包括牙釉质的厚度、硬度及颜色等的异常，主要分为4 类：发育不全型、钙化不全型、成熟不全型及复合型[3]。 AI 的遗传方式有常染色体显性遗传、 常染色体隐性遗传及X 性连锁遗传，目前研究者已经证实多个与AI 相关的致病基因，如釉原蛋白基因 （amelogenin，AMELX）、 釉蛋白基因（enamelin，ENAM）、激肽释放酶（kallikrein-4，KLK-4）编码基因等[1，4]。

FAM83H 属于FAM83 家族， 位于染色体8q24.3，包含5 个外显子，由1 179 个氨基酸组成，绝大部分氨基酸由五号外显子编码。该基因在2008年被首次报道与常染色体显性釉质钙化不全型AI相关， 目前所知道的致钙化不全型AI 的FAM83H基因突变众多，致病性突变通常位于最后一个外显子中编码287 位丝氨酸至694 位谷氨酸的序列之间[5-7]。 目前，关于FAM83H 突变导致钙化不全型AI的发病机制尚不清楚，本课题前期研究[8-9]发现，一个FAM83H 致病突变（c.1354C＞T， p.Gln452*）就能导致钙化不全型AI。为进一步理解AI 的发病机制，本研究利用细胞功能实验对FAM83H 第452 位谷氨酰胺位点突变的致病性进行验证。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

DMEM 高糖培养基，胰酶消化液，青/链霉素混合液（HyClone 公司，美国）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；TRIzol 试剂盒（Invitrogen 公司， 美国）；FAM83H 野生型及突变型病毒表达载体由上海创济生物科技有限公司（中国）设计合成；DAPI 溶液（Solarbio 公司，中国）；PCR 工作仪（Bio-red 公司，美国）；荧光定量PCR 仪（Roche 公司，德国）；荧光显微镜（Nikon 公司，日本）等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养永生化人胚胎肾上皮细胞HEK293T，并将其置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱内培养，1～2 d传代1 次。

1.2.2 稳转细胞系构建 将HEK293T 细胞铺在皿中，待细胞密度长至70%～80%后，分别转染pCDH慢病毒空载、pCDH-FAM83H-wild-HA 慢病毒表达载体及pCDH-FAM83H-mut-HA 慢病毒表达载体，Sanger 测序进行验证。 转染24 h 后，采用嘌呤霉素（puromycin）对细胞株进行筛选，筛选10 d 后，荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.3 RNA 提取与实时定量聚合酶链反应（RTqPCR） 上述3 组细胞稳转株以1×106/孔的密度接种于含有适量完全培养基的12 孔细胞培养板中，待细胞密度至80%～90%后， 将实验细胞用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3 次，使用TRIzol 法提取细胞总RNA，测量其浓度；根据TaKaRa 公司逆转录试剂盒说明书操作，将RNA 转换为cDNA；按照RT-qPCR 试剂说明书，进行操作。FAM83H 正向引物序列：5'-GGCCCCTCACATTTGGCTT-3'，反向引物序列：5'-GCAGATCCACGTCGGTAAACA-3'；内参对照GAPDH 正向引物序列：5'-CATCTGAGGGCCCACTG-3'，反向引物序列：5'-GAGGCCATGTAGGCCATGA-3'。 反应程序为30 s，95 ℃；5 s，95 ℃；30 s，60 ℃，共45 个循环。

1.2.4 免疫荧光 将灭菌处理的细胞爬片放入24 孔板中，以6×103/孔的密度将FAM83H-wild 和FAM83H-mut 细胞种于细胞爬片上。 细胞汇合达80%时，弃去培养基，PBS 溶液漂洗3 次，用4%多聚甲醛室温固定20 min；PBS 漂洗3 次，加入含DAPI 的荧光封片剂封片，固定后于荧光显微镜下观察。

1.2.5 统计学分析 采用GraphPad prism 8.0 软件对基因间的数据进行处理。 采用t检验法比较2 组之间的差异，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒表达载体构建

课题组前期文献及家系研究[8-9]发现，位于人类染色体Chr8q24.3 区域FAM83H 基因第5 号外显子的第1354 位发生C＞T 的杂合突变 （c.1354C＞T， p.Gln452*），该突变导致钙化不全型AI，且该位点氨基酸谷氨酰胺在小鼠、大鼠、狼、黑猩猩等物种中具有高度保守性，说明该位点对于维持FAM83H 基因的功能有重要作用。根据基因突变序列构建突变病毒载体，以期检测该位点突变后该蛋白对细胞的功能影响，对病毒载体进行测序确认载体构建成功（图1）。

图1 病毒表达载体测序结果Figure 1 Sequencing results of viral expression vector

2.2 载体转染效率检测

pCDH 慢病毒空载、pCDH-FAM83H-wild-HA 及pCDH-FAM83H-mut-HA 慢病毒表达载体分别感染对数期生长的293T 细胞，感染48～72 h 后，细胞高表达绿色荧光蛋白（图2）。

图2 转染后48 h 的细胞荧光图（×40）Figure 2 Fluorescence picture of cells 48 h after transfection（×40）

2.3 RT-qPCR 检测

RT-qPCR 结果显示，转染后，与野生型相比，突变型FAM83H mRNA 表达水平降低（图3）。

图3 RT-qPCR 结果Figure 3 RT-qPCR results

2.4 细胞荧光实验

FAM83H 蛋白免疫荧光发现， 野生型FAM83H蛋白主要在细胞质内， 而突变后的FAM83H 蛋白进入细胞核，这说明突变型FAM83H 导致AI 的主要机制可能为在细胞内的作用位点不同所导致的（图4）。

图4 2 组免疫荧光染色结果（×400）Figure 4 Immunofluorescence results of two groups（×400）

3 讨论

本研究成功构建了pCDH-FAM83H-wild-HA 慢病毒表达载体及pCDH-FAM83H-mut-HA 慢病毒表达载体。转染后，293T 细胞形态无明显变化，转染效率高，并且成功构建了293T 稳转细胞株。 FAM83H基因突变研究结果发现， 相较于野生型， 突变型FAM83H 的mRNA 表达水平降低；细胞荧光染色结果显示，突变后的FAM83H 蛋白主要作用在细胞核内，而野生型FAM83H 蛋白主要在胞质中。

FAM83H 是一个胞内蛋白，主要分布于高尔基体，因此推测其功能与高尔基体密切相关。FAM83H基因编码非特异性胞内蛋白，其除在牙齿发育过程表达外，还在肾、膀胱、喉及子宫等多种组织中表达[10]。Kim 等[11]在2008 年首次报道FAM83H 为钙化不全型AI 的主要致病基因， 随后越来越多的FAM83H 基因突变位点被发现，多数致病性突变位点均位于5 号外显子287 位至694 位氨基酸之间。Kweon 等[12]和Wang 等[13]构 建FAM83H 过 表 达 和 敲除转基因小鼠模型，发现小鼠釉质组织学形态无明显变化，表明单纯FAM83H 功能亢进或丧失可能不是导致AI 的主要致病机制。 目前比较认同的说法是，FAM83H 致病性突变可能导致蛋白作用区域发生变化， 同时细胞免疫荧光结果显示， 突变后的FAM83H 蛋白主要表达于细胞核中。 尽管FAM83H突变可逃避无义介导的mRNA 降解，有学者发现位于470 谷氨酰胺至610 位谷氨酸之间较少有无义突变的发生，可能与该区段作用于无义介导的mRNA降解相关，该区段无义突变后无法转录翻译，导致FAM83H 功能丧失， 患者临床釉质发育形态无异常，导致该区段突变报道较少[7]。 但实验结果发现突变后mRNA 表达降低，可能是突变后转录水平下降的原因[6]。 FAM83 蛋白家族的成员通过其共有的N端DUF1669 结构域与异位丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶CK1 家族的亚细胞相互作用并调节其亚细胞分布，FAM83H 与CK1 亚型共定位于细胞质和细胞核形成斑点状结构。Kuga 等[14]发现FAM83H 通过氨基端与CK1α 结合，羧基端与角蛋白丝结合，招募CK1α到角蛋白丝中调节角蛋白细胞骨架的形成；FAM83H 过表达的癌细胞中还有上皮细胞极性的缺失和E-钙黏蛋白的表达， 提示FAM83H 过表达诱导的CK1α 介导的角蛋白丝拆卸参与了结直肠癌的侵袭和/或转移。 同时相关研究表明，突变后的FAM83H 携同CK1α 入核，导致胞质内β-连环蛋白（β-catenin）磷酸化减少，转位入核增多，核积聚现象发生，致使Wnt/β-catenin 信号通路激活，抑制釉质矿化[15]。 此外，肝癌组织标本中FAM83H 的核表达与较高的肿瘤分期和较高的术前血清α-甲胎蛋白水平有显著关系，FAM83H 的表达升高对肝癌患者治疗效果及预后有着重要影响，同时原癌基因MYC参与了FAM83H 表达的转录调节[16]。 有研究表明，FAM83H 与NCK1/2 酪氨酸激酶相互作用和共定位，这种相互作用由FAM83H 末端富含脯氨酸的基序介导，它们与NCK1/2 的第2 个和第3 个SH3 结构域特异性地相互作用；而触发FAM83H C 端截短的致病性AI 突变蛋白保留了它们与CK1 亚型的相互作用，但与NCK1/2 失去了相互作用，其相互作用机制及影响尚不清楚[17]。 尽管对于釉质发育不全致病基因FAM83H 的研究越来越多，然而其在釉质形成过程中的机制尚不明确，需进一步探索FAM83H在釉质发育不全中的作用及致病机制，为釉质发育不全疾病的防治提供可靠依据。

综上所述，本文通过构建FAM83H 基因突变表达载体，对转染后的293T 细胞进行RT-qPCR 及细胞免疫荧光检测，分析突变后FAM83H 基本功能的变化，证明该位点突变后FAM83H 蛋白在细胞内作用位点发生了改变，FAM83H 在调控釉质形成的过程中，可能对多种不同的信号通路均有影响。 近期的研究表明，JNK 和p38 可能是FAM83H 表达的关键调控元件，JNK/p38 MAPK 通路在NaF 诱导的FAM83H 表达中起着至关重要的作用[18]；FAM83H通过调节CK1α 来调节经典Wnt/β-catenin 信号通路。这为我们发掘FAM83H 调控钙化不全型釉质发育不全症机制，提供了有力依据。 为了更好地利用FAM83H 在釉质发生、发展过程中的作用，促进釉质发育不全生物治疗的发展，有关FAM83H 在釉质形成过程中的作用，以及其突变后如何影响釉质形成，这些方面需要进一步探索。