GA3处理对木薯类胡萝卜素生物合成的影响

罗秀芹　薛晶晶　蔡杰　安飞飞　朱文丽　陈松笔

摘  要：木薯（ Crantz）屬大戟科木薯属热带作物，具有耐干旱贫瘠等特性，木薯叶片富含蛋白质，块根富含淀粉但是缺乏类胡萝卜素，是热带低收入人口的主粮。国家木薯产业技术体系“十三五”期间关于木薯产业问题指出，类胡萝卜素是粮饲化的重要指标，类胡萝卜素也是维生素A的前体物质。本文在前期研究中筛选到与类胡萝卜素生物合成相关转录因子MeGAMYB，MeGAMYB是一种受GA响应的转录因子。为了研究其如何介导GA促进类胡萝卜素生物合成的分子机制，明确其与类胡萝卜素含量及其生物合成途径基因的相关关系，本研究用50 mg/L浓度GA处理培养40 d的‘SC9’茎秆水培苗，在0、3、6、9、12 h取根、茎、叶和叶柄样品检测类胡萝卜生物合成中相关基因的表达情况以及在0、1、2、3、4 d检测类胡萝卜素含量，平行对照用水处理，结果显示：类胡萝卜代谢途径中相关基因以及类胡萝卜素生物合成受GA诱导，其中叶片在处理4 d时α-胡萝卜素含量最高达到0.19 μg/g，是对照的1.2倍;叶片中β-胡萝卜素含量在GA处理3 d时最高达107.73 μg/g，是对照的1.25倍，叶黄素和玉米黄质的含量在处理4 d内都随着GA处理时间延长含量呈不断增加的趋势。而类胡萝卜素生物合成相关基因如、、、、、、和等和转录因子MeGAMYB的表达量受GA均上调，其中、、、、和等基因的表达趋势与转录因子的表达趋势一致。本研究可以看出，GA能促进木薯类胡萝卜素的合成，通过调控类胡萝卜素生物合成相关基因的表达来促进类胡萝卜素的积累，但是具体的调控机制还需要进一步阐释。本结果为研究木薯类胡萝卜素代谢调控机制提供候选功能基因与转录因子，为阐述木薯类胡萝卜素生物合成的机制奠定基础。

关键词：木薯;类胡萝卜素;生物合成;赤霉素

中图分类号：S533      文献标识码：A

Effects of GA Treatment on Carotenoids Biosynthesis in Cassava

LUO Xiuqin XUE Jingjing  CAI Jie  AN Feifei ZHU Wenli CHEN Songbi

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences （CATAS）， Haikou， Hainan 571101， China

Crantz （Cassava） is a tropical crop of euphorbiaceae， with the characteristics of drought resistance and infertility. Cassava leaves are rich in protein， and its roots are rich in starch， while poor in carotenoids. Cassava is the staple food of low-income populations in the tropics. The Chinese Cassava Agro-technology System proposed that the content of carotenoids is an important index of cassava diet and feeding during the 13th Five-Year Plan. And carotenoids are also the precursor of vitamin A. A transcription factor MeGAMYB associated with carotenoids biosynthesis was screened out in the previous study， which is a transcription factor responsive to GA. In order to research the molecular mechanism of how MeGAMYB mediateing GA to promote carotenoids biosynthesis in cassava， and to clarify its correlation with carotenoids content and biosynthesis pathway genes， we treated ‘SC9’ seedlings， which grew up in water culture 40 days with 50 mg/L GA in present study， and collected the root， stem， leaf， and petiole samples on 0， 3， 6， 9， 12 hour to detect the gene expression in the carotenoids biosynthesis pathway， and extracted and detected the content of carotenoids on 0， 1， 2， 3， 4 day. The genes involved in the carotenoids metabolic pathway and carotenoids content were both induced by GA. The maximum content of α-carotene in the leaf was 0.19 μg/g with four days treatment， which was1.2 times than that of the control. The maximum content of β-carotene in the leaf was 107.73 μg/g with 3 days GA treatment， which was 1.25 times higher than that of the control. The content of lutein and zeaxanthin in the leaf increased with the extension of GA treatment in four days. The expression level of the carotenoids biosynthesis related genes such as ， ， ， ， ， ， and etc. and transcription factor MeGAMYB were all up-regulated in 50 mg/g GAtreatment. The expression trend of ， ， ， ， and etc. genes was the same as that of . The  study reveals that GAcan promote  carotenoids biosynthesis in cassava， through regulating the gene expression in carotenoids biosynthesis to promote the accumulation of carotenoids content. While the specific regulatory mechanism needs further explanation. The results would provide candidate genes and transcription factors MeGAMYB for studying carotenoids metabolic regulation mechanisms in cassava. Our research would lay a foundation for elucidating the mechanism of carotenoids biosynthesis in cassava.

M Crantz; carotenoids; biosynthesis; gibberellin （GA）

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.015

木薯是世界三大薯类作物之一，起源于热带美洲，是世界第六大粮食作物，因其适应性强，耐旱、耐贫瘠等优势而被广泛栽培于热带和部分亚热带地区，是热带湿地低收入农户的主要食粮，全世界约有8亿人用木薯作食物。除作为粮食作物外，木薯在化工、医药、纺织等方面均有重要作用，在我国南方，木薯主要作为我国淀粉和生物质能源的重要原料。木薯块根中块根富含淀粉，但是缺乏铁、锌、类胡萝卜素等。近年来，随着国家木薯产业技术体系提出木薯粮饲化和特用化的产业需求，木薯多用途的潜在价值逐渐得到发挥，如木薯作猪、牛、羊和蚕饲料。前期研究表明，不同木薯种质的块根、根、茎、叶及叶柄中都含有类胡萝卜素并且该性状受多基因控制。

类胡萝卜素是一种以异戊二烯为基础单位聚合而成的萜类化合物，类胡萝卜素种类有很多种，在高等植物中类胡萝卜素的合成除受光、氧气、营养物质等外部条件影响外，也受其激素及内在基因的调控。前期通过类胡萝卜素群体关联分析发现木薯转录因子GAMYB与其类胡萝卜素合成相关;激素是调控类胡萝卜素合成的关键非生物因子，木薯类胡萝卜素积累受激素调控，类胡萝卜素作为ABA生物合成的前体，外源喷施ABA能让木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白表达增强，β-胡萝卜素含量提高。据研究报道基因组成型过量表达，打乱了植株体内激素代谢平衡，使得赤霉素GA和脱落酸ABA的合成量减少，引起植株生长异常，反而最终抑制类胡萝卜素合成，说明类胡萝卜素的合成受植物激素ABA和GA的影响。因此本文采用‘SC9’木薯茎秆水培苗为研究对象，用GA诱导木薯水培苗，对木薯叶片中4种类胡萝卜素的积累均起到不同程度的促进作用，分析GA对木薯根、茎、叶和叶柄中类胡萝卜素生物合成相关基因及转录因子的表达情况和类胡萝卜素的含量之间的关系，从而为阐释木薯GAMYB转录因子介导GA促进木薯类胡萝卜素生物合成的分子机制奠定基础。

 材料与方法

  材料

供试材料为‘SC9’成熟期木薯茎秆，‘SC9’为中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家审定品种，种植于儋州市国家木薯种质资源圃。

  方法

‘SC9’木薯茎秆用300 mL塑料杯自来水培养，每隔3 d换一次水，室外正常光照。40 d后，用50 mg/L GA水溶液替换自来水进行处理，分别在0、3、6、9、12 h取根、茎、叶和叶柄样品，用qRT-PCR技术检测类胡萝卜素生物合成途径中相关基因及转录因子的表达情况和检测0、1、2、3、4 d取根、茎、叶和叶柄样品，用HPLC技术检测类胡萝卜素的含量。平行对照用自来水处理相同时间点取样检测。每个时间点3个生物学重复。

1.2.1  RNA的提取与定量PCR  保存的样品用液氮研磨至粉碎，称取约0.1 g粉末参照TIANGEN植物总RNA 提取试剂盒（多糖多酚类）提取根、茎、叶和叶柄的总RNA，用nanodrop和琼脂糖凝胶电泳分别检测RNA浓度以及完整度，反转录合成cDNA第一链参照TRANSGEN公司cDNA第一链合成试剂盒。

通过Phytozome 13网站查找到转录因子及木薯类胡萝卜素生物合成相关基因的序列，并用Primier 5进行定量引物设计，包括、、、、、、、、、和以及内参基因为（表1）。利用合成的cDNA第一链稀释5倍为模板，用诺唯赞生物技术有限公司的SYBR Premix Ex Taq II 进行定量PCR。

1.2.2  类胡萝卜素的提取与测定  保存的样品用液氮研磨至粉碎，根、茎、叶和叶柄称取约0.5 g粉末，加入5.0 mL的三氯乙烷∶无水乙醇（∶=1∶1）提取液，12 000 r/min离心5 min，取3.0 mL上清液用氮气吹干，加入0.6 mL 20%氢氧化钾-甲醇复溶，50℃水浴60 min，用0.22 μm的有机相滤膜过滤后待测备用。

吸取0.2 mL过滤样品于内衬管，放置液相样品瓶中，HPLC测定类胡萝卜素含量。测定条件：色谱柱agilentHC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 µm）;流动相：乙腈A、异丙醇B;洗脱程序：0～10 min，100%A，0～15 min，20%A，15～30 min，100%A;流速：1 mL/min;进样量：10 µL;柱温为室温;检测波长：450 nm。α-胡萝卜素（纯度>98%）、β-胡蘿卜（纯度>98%）、叶黄素（纯度>98%）、玉米黄质（纯度>98%）等标准品为Sigma公司，标准品均用甲醇溶解稀释。

   数据处理

利用Excel软件分析定量结果，采用2方法计算基因的相对表达量，结果以平均值加标准差表示。

  结果与分析

 GA处理对‘’木薯水培苗-胡萝卜素含量的影响

从图1可以看出，GA诱导能促进木薯中α-胡萝卜素的合成，其中α-胡萝卜素含量在GA处理4 d时达到最高，为0.19 μg/g，而对照在相同时间点几乎无明显变化。

  GA处理对‘’木薯水培苗胡萝卜素含量的影响

从图2可以看出叶片中β-胡萝卜素本底水平较高，GA诱导能促进木薯中β-胡萝卜素的合成，其含量在0、1、2、3、4 d均比对照高，其中β-胡萝卜素在GA处理2 d时达到最高，为107.73 μg/g，随后呈下降趋势;而对照在相同时间点几乎无明显变化。

  GA处理对‘’木薯水培苗叶黄素含量的影响

从图3可以看出，GA诱导能促进木薯中叶黄素的合成，其含量在0、1、2、3、4 d呈逐渐增加的趋势，4 d内达到0.31 μg/g，但未达峰值，还有上升空间;而对照在相同时间点几乎无明显变化。

  GA处理对‘’木薯水培苗玉米黄质含量的影响

从图4可以看出，GA诱导能促进木薯中玉米黄质的合成，玉米黄质含量本底水平较高，GA处理后均比对照高，在3 d达到峰值;而对照在相同时间点几乎无明显变化。

  GA处理对‘’木薯水培苗不同组织中类胡萝卜素生物合成相关基因的影响

从图5可以看出，类胡萝卜素生物合成相关

基因在12 h内根、茎、叶和叶柄中均受GA不同程度的诱导，其中、、、、和在叶片中诱导效果较明显，而、和在根中诱导效果明显。其中GA调控的转录因子在叶片中受GA诱导最明显，而对照在相同时间点几乎无明显变化。

  GA处理类胡萝卜素含量与生物合成相关基因的相关性分析

除番茄红素在叶片中无法检测到外，GA均能促进叶片中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质的积累。而叶片中β-胡萝卜素和玉米黄质含量占90%以上，转录因子及木薯類胡萝卜素生物合成相关基因表达在根、茎、叶和叶柄等不同器官、组织中均受GA诱导调控，其中、、、、和在叶片中诱导效果较明显，与GA调控的转录因子表达基本呈一致趋势，初步可以筛选出受转录因子MeGAMYB调控的基因如、、、、和等。

  讨论

GA是一类重要的植物激素，其在延缓植物叶片衰老、抑制叶绿素的降解、植物开花诱导和果实发育过程起着重要作用。是一个受GA调控的编码一个R2R3-MYB DNA结合结构域的类转录因子，是GA信号应答途径中首个被鉴定出来的正向作用的因子，在拟南芥和水稻中，mir159调控的GAMYB-like家族转录因子主要在花发育和谷物糊粉层重点GA信号转导。其中GID1（Gibberellin-Iinsensitivedwarf1）是GA

的受体，其能感知GA信号通过受体GID1蛋白传给DELLA，DELLA蛋白属于GA信号和植物生长发育的关键抑制因子，而GA促进植物的生长发育是通过降解DELLA蛋白来完成。GA跟GID1与DELLA蛋白的相互作用会引起一些转录因子如和等转录因子基因表达量的上调但是对于在类胡萝卜素代谢中的调控机理研究相对较少。

类胡萝卜素是木薯粮饲化的重要指标，木薯中类胡萝卜素主要包括有α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素和番茄红素等。据研究报道，木薯块根中仅β-胡萝卜素含量占总类胡萝卜素含量的90%，而本研究以木薯叶片为研究对象，与块根研究结果不同，木薯叶片中主要含有β-胡萝卜素和玉米黄质，二者含量占90%以上，而α-胡萝卜素和叶黄素占极少的部分。本文在GA的作用下，木薯水培苗各个组织中类胡萝卜素代谢途径中的基因和都受到不同程度的调控，特别是叶片中的表达量出现了显著上调，同时，相关基因如、等也出现了显著上调。基于本文研究结果可以推测，在GA信号条件下，GA信号分子与 GID受体蛋白结合从而导致植物生长的抑制因子DELLA蛋白通过泛素-蛋白酶体途径被降解，与DELLA蛋白相互作用促进了类胡萝卜素生物合成途径相关基因的表达，从而促进了类胡萝卜素的生物合成，但是具体的机理研究还需要进一步探索。本结果为后续研究木薯类胡萝卜素代谢提供了候选基因和相关的转录因子，为进一步研究木薯类胡萝卜素合成的机理提供参考，也为提高木薯叶片和块根中类胡萝卜素含量的研究奠定了基础。

参考文献

1. MCDOWELL I， ODURO K A. Investigation of the β-carotene in yellow varieties of cassava （） [J]. Journal of Plant Foods， 1983（5）： 169-171.
2. 周璐丽， 王定发， 张振文， 陈松笔， 周汉林. 华南7号木薯茎叶营养价值评价[J]. 热带作物学报， 2016， 37（12）： 2245- 2249.ZHOU L L， WANG D F， ZHANG Z W， CHEN S B， ZHOU H L. Nutritional value of stems and leaves of Crantz cv. South China 7[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2016， 37（12）： 2245-2249. （in Chinese）
3. 杜冰雪， 陈松笔， 李开绵， 朱文丽， 罗秀芹. 木薯蚕蛹虫草的人工栽培[J]. 热带农业科学， 2020， 40（10）： 68-71.DU B X， CHEN S B， LI K M， ZHU W L， LUO X Q. Cultivation of on cassava silkworm pupae[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 2020， 40（10）： 68-71. （in Chinese）
4. 罗秀芹， 杨  龙， 肖鑫辉， 陈松笔. 木薯块根类胡萝卜素积累与主要基因表达谱分析[J]. 福建农林大学学报， 2018， 47（2）： 1-11.LUO X Q， YANG L， XIAO X H， CHEN S B. Analysis of carotenoids accumulation and main genes expression profile in cassava storage root[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University （Natural Science Edition）， 2018， 47（2）： 1-11. （in Chinese）
5. LUO X Q， KEITH I T， LUIZ J C B， LI K M， CHEN S B. The analysis of vandidate genes and loci involved with carotenoid metabolism in cassava （ Carntz） using SLAF-seq[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2018（40）： 66.
6. YAMAGUCHI S， SMITH M W， BROWN R G S， KAMIYA Y， SUN T. Phytochrome regulation and differential expression of gibberellin 3beta-hydroxylase genes in germinating seeds[J]. The Plant Cell， 1998， 10（12）： 2115- 2126.
7. GOCAL G F， SHELDON C C.， F GUBLER， MORITZ T， BAGNALL D J， MACMILLAN C P， LI S F， PARISH R W， DENNIS E S， WEIGEL D， KING R W. genes， flowering， and gibberellin signaling in [J]. Plant Physiology， 2001， 127（4）： 1682-1693.
8. HUANG B Y， QIAN P P， GAO N， SHEN J， HOU S W. Fackel interacts with gibberellic acid signaling and vernalization to mediate flowering in [J]. Planta， 2017， 245（5）： 939-950.
9. BAI M Y， SHANG J X， OH E， FAN M， BAI Y， ZENTELLA R， SUN T P， WANG Z Y. Brassinosteroid， gibberellin and phytochrome impinge on a common transcription module in [J]. Natture Cell Biology， 2012， 14（8）： 810-817.
10. GALLEGO-BARTOLOME J， MINGUET E G， GRAU- ENGUIX F， ABBAS M， LOCASCIO A， THOMAS S G， ALABADI D， BLAZQUEZ M A. Molecular mechanism for the interaction between gibberellin and brassinosteroid signaling pathways in [J]. Proceeding of National Academy of Sciences of the United States America， 2012， 109（33）： 13446-13451.
11. CARVALHO L M J， OLIVEIRA A R G， GODOY R L O， PACHECO S， NUTTI M， DE CARVALHO J L V， PEREIRA E， FUKUDA. Retention of total carotenoid and β-carotene in yellow sweet cassava （ Crantz） after domestic cooking[J]. Food & Nutrition Research， 2012， 56： 15788.

12. 收稿日期 2021-08-21;修回日期 2021-11-30

    基金项目 国家自然科学基金青年科学基金项目（No. 32101811）;海南省自然科学基金青年科学基金项目（No. 321QN321）;

    中央级公益性科研院所基本科研业务费专项-中国热带农业科学院院级创新团队项目（No. 17CXTD-29）。

    作者简介 罗秀芹（1986—），女，硕士，助理研究员，研究方向：木薯遗传育种。*通信作者（Corresponding author）：陈松

    笔（CHEN Songbi），E-mail：563962186@qq.com。