湘产浓香型白酒酿造过程中氨基甲酸乙酯含量变化规律

黄雄伟 李文祥 曾宪峰 李 青 张建辉

(1. 湖南省产商品评审中心，湖南 长沙 410000；2. 湖南志成食品技术服务有限公司，湖南 长沙 410000；3. 广电计量检测〔湖南〕有限公司，湖南 长沙 410007)

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)又名尿烷、胺甲酸乙酯等，是一种具有致突变性、免疫抑制性及心率抑制性的2A类致癌物质[1-2]，广泛存在于酿造酒等发酵产品中[3-4]。因此，部分国家制定了酒精饮料中EC的限量标准。如加拿大对佐餐葡萄酒限量值为0.03 mg/L，加强葡萄酒限量值为0.1 mg/L，蒸馏酒限量值为0.15 mg/L，烈性酒和水果白兰地限量值为0.4 mg/L[5]。美国FDA规定：1988年以后生产的佐餐葡萄酒(酒精度≤14%)EC含量不能超过0.015 mg/L，1989年以后生产的甜葡萄酒(酒精度≥14%)EC含量不能超过0.06 mg/L。2002年联合国粮农组织将其作为重点监控物质，并制定了国际标准，含量不得超过0.02 mg/L[6]。

湘产浓香型白酒具有悠久的历史。近年来，白酒中EC的含量调查、机理形成，含量控制以及风险评估等研究日益引起人们的关注[7-9]，但研究对象均为基酒(包括生产企业自产的基酒和实验室蒸馏后的基酒)，而有关窖泥、酒醅和酒糟中EC含量的测定及变化规律研究尚未见报道。研究拟对原粮、窖泥、酒醅、酒糟以及基酒中的EC含量进行检测，并采用统计分析手段对不同工艺流程中的含量进行分析，旨在为提高浓香型白酒的安全性提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

自2021年3月起，于湖南省内某浓香型白酒生产企业采集183批次样品，其中粮食原料样品7批次，窖泥样品36批次，酒醅样品64批次，酒糟样品10批次，新酿基酒样品48批次，贮存年份基酒18批次。

1.2 试剂和设备

二氯甲烷、正己烷、乙腈：色谱纯，默克化工技术(上海)有限公司；

氯化钠、乙二胺-N-丙基(PSA)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

氨基甲酸乙酯标准品：上海安谱实验科技股份有限公司；

气相色谱—质谱仪：Agilent 7890B-5977A型，安捷伦科技(中国)有限公司；

旋转蒸发仪：Hei-VAP Advantage ML/G3型，广州市京度进出口有限公司；

电子天平：ME204E型，梅特勒—托利多科技(中国)有限公司；

离心机：TDL-5A型，广州云星科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 毛细管色谱柱为HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度220 ℃；不分流进样；进样量1 μL；柱温：初温50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃。载气为氦气，纯度≥99.999%，流速1 mL/min。

1.3.2 质谱条件 电子轰击源(EI)，能量为70 eV；四级杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；溶剂延迟5 min；选择离子监测(SIM)；氨基甲酸乙酯选择监测离子(m/z) 44，62，74，89，定量离子62。

1.3.3 检测方法 准确称取10.00 g试样于浓缩瓶，40 ℃ 水浴减压浓缩至液体少于2 mL，用水洗涤转移至50 mL离心管中，加水使液体最终体积为10 mL，加入适量氯化钠振摇使其过饱和。加入10 mL二氯甲烷，涡旋混匀1 min，4 000 r/min离心3 min，将下层有机相转移入浓缩瓶中。水相中加入10 mL二氯甲烷，重复提取2次，合并下层有机相，40 ℃水浴减压浓缩至近干。

准确移取2 mL乙腈至浓缩瓶中，溶解残渣并转移至10 mL离心管中，加入2 mL正己烷，涡旋混匀1 min，4 000 r/min 离心3 min，弃去正己烷相，加入2 mL正己烷重复净化1次。向乙腈相中加入0.05 g PSA填料，涡旋混匀1 min，过0.45 μm有机相滤膜。GC-MS外标法定量测定。

1.4 数据处理与统计

采用Excel 2016统计软件进行数据统计与整理；t检验采用SPSS 22.0数据分析软件。

2 结果与分析

2.1 酿造过程中不同物料氨基甲酸乙酯含量

由表1可知，7批次原粮均未检出EC，窖泥、酒糟、酒醅、新酿基酒(含酒头、酒尾)和贮存基酒(贮存期1～10年不等)的EC平均检出值分别为84，124，170，270，325 μg/kg，EC检出率分别为72.2%，90.0%，98.4%，98.0%，100.0%。

表1 样品检测结果†

原粮中未检出EC，说明原粮本身不含有EC，但原料产区和品种的不同会影响白酒中EC含量，这与原粮发酵过程产生的尿素等前体物质的含量高低有关[10]。白酒中EC的产生和积累与前体物质尿素含量具有较大相关性[11]，由尿素与乙醇反应生成；窖泥中含有一定量的尿素，但乙醇含量较低，因此其EC含量相较于酒醅、酒糟的要低；白酒在蒸馏过程中温度可达100 ℃，EC沸点为184 ℃，但由于其溶于水和乙醇，有少量酒醅中的EC经蒸汽流入基酒中，因此酒醅中的EC含量要高于酒糟；而基酒中的EC主要在蒸馏过程中和蒸馏后贮存过程中产生。

2.2 不同蒸馏段基酒中氨基甲酸乙酯含量

由表2可知，酒头和酒尾EC含量显著性检验P=0.041<0.05，说明酒头和酒尾间存在显著差异，且酒头EC含量显著高于酒尾；中间段基酒和酒头、酒尾间显著性检验P值分别为0.516，0.071，不显著，具体原因尚需进一步研究，这与张莹等[12]的结果基本一致，进一步证实了浓香型白酒在蒸馏过程中“掐头”的重要性。

表2 不同蒸馏段基酒t检验方差分析表(LSD多重比较)†

2.3 不同层酒醅和基酒中氨基甲酸乙酯含量

对采集的上、中、下3层酒醅和基酒(掐头去尾后)按试验方法分别进行含量检测，采用SPSS对检测结果进行方差分析，结果表明不同层酒醅EC含量显著性P=0.770>0.05，不同层基酒EC含量显著性P=0.980>0.05，因此不同层酒醅和基酒间的EC含量无显著性差异。不同层酒醅EC含量无显著性差异可能是由于不同层酒醅之间的活性微生物数目差异较小，群落组成无明显差异[13]，使得产生的尿素等EC前体物质无显著性差异。而不同层基酒EC含量无显著性差异的原因与基酒中的EC含量形成机理(主要为蒸馏过程中产生)有关[7]。

2.4 贮藏时间对氨基甲酸乙酯含量的影响

由图1可知，随着贮藏时间的延长，无论是酒头、酒尾还是中间段基酒，EC含量均有不同程度的升高，升高幅度为0.5～2.0倍，EC含量随贮藏时间的延长而升高的原因可能与其前体物质尿素或氰化物等含量有关[14-15]。从绝对增长幅度来看，酒头>中间段基酒>酒尾，其原因可能是酒头、中间段基酒中EC的前体物质继续与乙醇生成EC。

图1 基酒EC含量与贮藏时间关系图

由图2可知，不同品种浓香型白酒贮存3～5年后，EC含量逐渐达到峰值，随后慢慢回落至1年贮存期水平，与张莹等[12]的结论基本一致，具体原因尚需进一步研究。

图2 年份基酒EC含量与贮藏年份关系图

3 结论

试验表明，浓香型白酒各工艺阶段中，酒糟、酒醅、基酒以及窖泥中普遍存在氨基甲酸乙酯，酒醅中氨基甲酸乙酯含量高于酒糟，且不同蒸馏段基酒中酒头的氨基甲酸乙酯含量显著高于酒尾。基酒存放过程中，酒头中氨基甲酸乙酯含量的绝对增幅高于中间段基酒和酒尾，因此，“掐头”是降低成品酒中氨基甲酸乙酯含量的有效手段。浓香型白酒的基酒和酒醅中氨基甲酸乙酯含量无相关性，个别基酒中的氨基甲酸乙酯含量甚至高于酒醅，说明浓香型白酒中的氨基甲酸乙酯主要来源于蒸馏过程和贮存过程。因此如何降低发酵过程中产生的氨基甲酸乙酯前体物质含量，减少蒸馏和贮存过程中氨基甲酸乙酯的生成，是企业控制成品白酒中氨基甲酸乙酯含量的重点。同时，浓香型白酒贮存3～5年后，氨基甲酸乙酯含量逐渐达到峰值，随后有所下降，具体原因尚需进一步研究。