消痰化瘀利窍方对CIH大鼠心肌局部肾素-血管紧张素系统的影响

2022-03-05 00:01任静李杰茹郭亚净杨胜昌韩聚强李文雅赵洋吉恩生
中国老年学杂志 2022年4期
关键词:醛固酮心肌血管

任静 李杰茹 郭亚净 杨胜昌 韩聚强 李文雅 赵洋 吉恩生

(河北中医学院 1中西医结合学院,河北 石家庄 050020;2生理教研室;3低氧生理与病理生理实验室)

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的主要危害是慢性间歇性低氧(CIH)造成心、脑、肾、血管等多脏器损害〔1〕。OSA诱发心脏病变是源于CIH引起的心肌组织代谢紊乱和结构异常。CIH是OSA患者易合并心血管病变如高血压、冠心病和心力衰竭的病理基础〔2〕。研究表明CIH引起的系统性炎症反应、氧化应激、交感神经兴奋性增加、内皮功能损伤等是OSA 并发心血管病变的主要机制〔3〕。心脏局部肾素-血管紧张素系统(RAS)在OSA诱发心脏病变的发生发展中发挥重要作用〔4〕。抑制局部 RAS 的激活,阻断 RAS 的作用可作为预防和治疗的OSA引发心脏病变重要环节。消痰化瘀利窍方(XHLR) 是针对于OSA的“痰湿、血瘀、气滞”等病机特点而创设的有效组方,多年的临床实践证明,该方对OSA患者具有较好的临床治疗效果。前期研究结果显示,XHLR可抑制 CIH 大鼠心肌纤维化和心肌肥大等病变〔5〕,提示XHLR对预防OSA继发心脏病变具有较好的效果。鉴于此,本研究基于心肌局部 RAS 探讨XHLR缓解 CIH 大鼠心肌病变的初步机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级的雄性SD大鼠,体重180~220 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号:SCXK〔京〕2016-0006。

1.1.2药物 XHLR由丹参30 g、赤芍15 g、生黄芪15 g、茯苓15 g、枳壳15 g、法半夏12 g、炒白术12 g、石菖蒲12 g、郁金12 g、射干12 g、桔梗12 g、川芎12 g、地龙12 g、陈皮10 g、白芥子10 g组成。按以上组方比例由河北省神威药业集团有限公司购进各药材饮片。由本校中药化学教研室制备实验用药液。应用水煮醇沉制备工艺将以上中药饮片制备成生药含量为 2.5 g/ml的液体药剂。

1.1.3试剂 血管紧张素(Ang)Ⅱ及醛固酮酶联免疫试剂盒购于南京建成生物工程研究所;兔抗鼠c-jun抗体、兔抗鼠AngⅡ受体1(AT1R)抗体、兔抗鼠蛋白激酶(PK)C抗体及兔抗鼠Tublin单克隆抗体均购于武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CIH造模及分组 SD大鼠随机分为常氧(Normoxia)组、中药对照(Formula)组、CIH组、CIH+中药干预(Formula+CIH)组,每组8只。在动物实验室适应性饲养1 w后,进行CIH造模。动物CIH舱的制备流程,首先向舱内充入100%N2,时间持续1.5 min,使舱内O2浓度降至9%后,再向舱内充入医用纯氧1.5 min,使舱内O2浓度升至 21%,3 min为一循环。CIH组和Formula+CIH组的大鼠暴露于CIH舱,每天8 h(9∶00~17∶00),持续3 w。此外,Formula+CIH组与 Formula组的大鼠在每次上舱前开始灌胃给药,XHLR药量25 g/(kg·d) (参照动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表计算动物用药剂量),CIH组与Normoxia 组灌胃等体积蒸馏水,连续3 w。于造模3 w后,大鼠禁食12 h后,戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉,颈总动脉采血后,开胸取出心脏,一部分心脏组织置于4%的多聚甲醛液中固定,备用于免疫组织化学染色,另一部分放入-80℃冰箱中保存,供Western印迹,q-PCR检测。

1.2.2免疫组织化学染色法检测心肌组织AT1R 表达 石蜡切片,常规脱蜡、水化、3%H2O2消除内源性过氧化物酶的活性,5%~10%正常山羊血清封闭修复抗原后,滴加一抗(1∶100)工作液,4℃过夜。PBS 冲洗后,滴加适量生物素标记二抗工作液37℃孵育60 min,滴加适量的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,孵育30 min,PBS冲洗后,二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色。

1.2.3RAS相关指标 取左心室肌组织适量,制成匀浆液,4 000 r/min,4℃离心20 min,取上清液于-80℃冻存备用。按酶联免疫法测定匀浆液AngⅡ及醛固酮含量。

1.2.4心肌组织中血管紧张素转换酶(ACE) mRNA 及ACE2表达测定 取适量冻存的心肌组织,用Trizol试剂提取总RNA,用通用反转录试剂盒(M-MLV)逆转录酶(RR047A,TaKaRa,大连)将1 μg总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,所需反应溶液包含40 ng cDNA、目的基因特异性引物和2 X宝生物染料法荧光定量试剂盒(RR820A,TaKaRa,大连)。以 GAPDH 作为内参。根据以下参数见Table1进行反应:预变性95℃×5 min,变性 94℃×30 s,退火 60℃×30 s,延伸72℃×30 s,共 40 个循环。用荧光定量PCR(Bio-Rad,CFX Connection,Hercules,USA)检测PCR扩增。引物序列见表1。用ΔΔCt 值法,以 GAPDH 为内参定量目的基因(ACE、ACE2) mRNA表达量。

表1 PCR引物序列

1.2.5Western印迹检测蛋白表达 将适量心肌组织制成匀浆,以12 000 r/min的转速将所制匀浆在4℃温度下离心15 min后,取其上清,采用二喹啉甲酸(BCA)法测其蛋白浓度,制成蛋白样品。取适量蛋白上样,十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后转膜,5%脱脂牛奶封闭 1.5 h,TBST液洗涤3次,然后分别给予1∶1 000 稀释的兔抗大鼠PKC抗体、兔抗大鼠c-jun抗体,4℃冰箱孵育过夜;TBST冲洗,加入滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育1.5 h,TBST 洗涤,电化学发光(ECL)显色,灰度扫描后,用 Quantity One 分析软件对蛋白电泳条带进行分析,以目标蛋白条带灰度/内参Tublin条带灰度值表示所测指标的蛋白表达。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1XHLR降低CIH大鼠心肌组织中 Ang Ⅱ、醛固酮的含量 与Normoxia组比较,CIH组心肌组织中 Ang Ⅱ、醛固酮的含量明显升高,而与CIH组相比,CIH+Formula组 Ang Ⅱ、醛固酮的含量明显降低,见表2。

表2 各组心肌组织 AngⅡ、醛固酮的含量

2.2各组ACE、ACE2 mRNA表达比较 与Normoxia组相比,CIH组心肌组织中ACE mRNA表达水平明显增多,ACE2 mRNA表达下降。与CIH组比较,CIH+Formula组心肌组织中ACE mRNA表达被抑制,ACE2 mRNA表达水平明显升高,见表3。

表3 Q-PCR法检测各组心肌组织 ACE和ACE2 mRNA表达

2.3XHLR抑制CIH大鼠心肌组织中PKC和c-jun蛋白的表达 与Normoxia组比较,CIH组心肌组织中PKC和c-jun蛋白表达水平升高,而与CIH组相比,CIH+Formula组心肌组织中PKC和c-jun蛋白表达水平明显下降。见图1、表4。

1~4:Normoxia组,CIH组,Formula+CIH组,Formula组图1 Western印迹法检测各组心肌组织 PKC和c-jun蛋白表达水平

表4 各组PKC、c-jun、AT1R表达比较

2.4XHLR降低CIH大鼠心肌组织中AT1R的表达 与Normoxia组比较,CIH组心肌组织中AT1R蛋白表达水平升高,与CIH组相比,CIH+Formula组心肌组织中AT1R蛋白表达明显下降。见表4、图2。

图2 各组心肌组织AT1R的表达情况(DAB,×400)

3 讨 论

OSA 的主要病理生理特征是夜间睡眠过程中反复发生的间歇性低氧(IH),这种反复的低氧、复氧刺激机体的内分泌机制,并且激活循环中的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)〔6,7〕。循环中的RAAS,由肾脏的球旁细胞分泌的肾素进入循环血,降解肝脏分泌的血管紧张素原生成AngⅠ,AngⅠ再在ACE的作用下生成AngⅡ。AngⅡ引起血管收缩、刺激醛固酮产生、促使水钠潴留、促进血管平滑肌细胞增生等效应,使血压升高〔8〕。IH可以通过激活循环RAAS诱导高血压的发生〔9〕。CIH可以刺激颈动脉体的化学感受器,从而激活全身交感神经系统和RAS〔10〕。将大鼠暴露于低氧环境中7 d 后,监测到其 ACE、AngⅡ与 AT1R水平较正常对照组显著增加〔11〕。并且近年来研究发现CIH也可激活心脏局部RAS进而促进心血管病变的发展〔4〕。作为RAS关键酶的ACE,通过多种分泌方式参与RAS的全身和局部作用。AngⅡ是ACE的产物,ACE可通过产生AngⅡ损伤心血管系统〔12〕。本研究提示XHLR通过抑制CIH诱导ACE基因的表达,使Ang Ⅱ和醛固酮生成减少,以减缓轻心肌病变的发生。

ACE2作为RAS的一个新成员,可以抑制RAS,并具有血管舒张和抗增殖功能〔13〕。ACE2 是一种专一的单羧基肽酶,可以将AngⅠ降解为Ang(1~9),同时可将Ang Ⅱ降解为Ang(1~7),但ACE2分解Ang Ⅱ的速率远高于其分解AngⅠ〔14〕。因此,激活 ACE2活性,是降低 AngⅡ的重要途径之一,可有效地降低血压〔15〕。本研究发现,CIH模型大鼠心肌组织ACE2 基因表达明显降低。XHLR可使心肌ACE2 mRNA表达水平升高,减缓心肌病变的发生。

AngⅡ 作为 RAS的重要成员之一,与受体结合后发挥其生理与病理作用,一般认为其受体主要有 AT1R和AT2R两种,AngⅡ与AT1R结合产生收缩血管及促进炎症发生等作用〔16〕,还可增加氧化应激、凋亡和心脏重构,最终导致心力衰竭〔17〕。本研究提示XHLR可减弱CIH诱导的AngⅡ生成,降低AT1R的表达。

RAS在心血管系统病变中扮演的重要的角色,心肌组织中的AngⅡ 通过自分泌和(或)旁分泌机制作用于AT1R,经G蛋白耦联作用,激活磷脂酰肌醇特异性磷酸酯酶C,引起心肌细胞膜外钙离子跨膜内流和胞质内钙离子贮存池释放增加,并诱导激活PKC,进而引发即刻早期反应基因c-jun的表达,增加蛋白质合成,激发心肌肥大、间质纤维组织增生〔18〕。本研究提示XHLR可通过降低心内RAS活性进而阻断PKC/c-jun通路改善CIH大鼠的心脏功能。

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