银杏叶提取物对糖尿病肾病大鼠肾功能、心功能、炎性反应、β2-MG及RBP4水平的影响

2022-03-05 06:44江梅刘曙艳牛万彬
中医药信息 2022年2期
关键词:货号肾小管银杏叶

江梅,刘曙艳,牛万彬

(焦作市第二人民医院,河南 焦作 454150)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)在临床上最常见的慢性并发症之一,主要症状表现为高血糖、胰岛素分泌缺乏及代谢紊乱等,易造成机体微循环障碍、刺激机体炎症反应,严重时可引起终末期肾脏疾病,影响患者的治疗及预后[1-2]。目前,临床关于DN 的发生机制尚未完全明确,但较多研究指出其与糖代谢紊乱、血脂代谢异常、炎性反应等密切有关。且近年来较多研究发现,肾小管损伤与DN 进展及预后关系密切,因此早期干预治疗具有十分重要的作用[3]。黄酮类、萜类内酯为银杏叶提取物(GBE)的主要活性成分,具有抗氧化、抗凋亡、抗炎及心肌保护等药理作用,因此被广泛应用于心脑血管疾病的治疗[4-5]。目前,临床关于GBE 在DN 中的临床研究较多,但大都集中于DN 肾功能及炎性反应方面,关于GBE 对DN 肾小管功能的作用研究较少[6]。为进一步探究GBE对DN的防治效果,本研究从肾功能、肾小管、炎性反应及心功能等方面出发,观察GBE 干预下DN 大鼠体内肾功能、肾小管、炎性反应及心功能的变化,为临床DN 的防治提供参考,结果如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选取健康8周龄雄性SD(清洁级)大鼠36只,实验前所有大鼠均进行适应性喂养,为期1周,室内分组笼养,控制室温为(22 ± 2)℃,并在8∶00—20∶00 时间段进行自然光线或开灯照射,其余时间均关灯。实验大鼠均为专人负责喂养,饮水自由,喂养饲料和饮用水的量均依照大鼠成长速度进行调节。实验大鼠及喂养饲料均购自福州福医大实验动物有限公司。

1.2 实验试剂及器材

1.2.1 试剂及药品

链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ);银杏叶片(每片含黄酮醇苷9.6 mg 及萜类内酯2.4 mg,国药准字Z20053069,海口奇力制药股份有限公司,9.6 mg ×24 s);24 h 尿蛋白(货号:C035-2)、BUN(货号:20160511)、Cr(货号:C011-2)、IL-6(货号:000004)、IL-8(货号:L00417)、TNF-α(货号:YM-S0122)、β2-MG(货号:KGE019)及RBP4(货号:DRB400)试剂盒均购自上海博湖生物科技有限公司。

1.2.2 主要仪器设备

德国Simens 公司Acuson Sequoia512C 彩色多普勒超声诊断系统(配备15L8w-S 线阵探头,频率为12~14 MHz);超速低温离心机;精密电子天平;日立7600全自动生化分析仪(日本)。

1.3 分组及造模

36 只雄性大鼠,体质量200~250 g,随机分为3 组,分别为对照组、糖尿病肾病模型组(DN 组)及银杏叶提取物干预组(DN + GBE 组),每组12 只。对照组不予造模,DN 组及DN + GBE 组均参照2015年Elsherbiny 建模方法完成DM 诱导DN 模型。然后对DN 组及DN+GBE 组一次性腹腔注射STZ 溶液(由pH值为4.5 的柠檬酸钠缓冲液配置而成),注射剂量为60 mg/kg。对照组大鼠采用等体积pH 值为4.5的缓冲液注射。建模48 h后,检测大鼠空腹血糖,血糖水平超过250 mg/dL的大鼠视为糖尿病造模成功。

1.4 给药方法

DN + GBE 组给予GBE 干预,灌胃前使用蒸馏水将药物稀释,剂量为96 mg/kg;对照组及DN 组给予同等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续12周。

1.5 观测指标

1.5.1 大鼠一般情况

实验期间,观察各组大鼠饮水情况、进食情况、尿量、体质量及精神状况等。

1.5.2 肾功能指标水平

分别在干预第4、8、12 周将大鼠置于代谢笼中,收集大鼠尿液进行24 h 尿蛋白定量检测;同时采集大鼠主动脉血,抗凝处理,离心,分离血清,并保存于-20 ℃备测,尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)采用日立7600 全自动生化分析仪检测。

1.5.3 炎性因子水平

白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)均采用ELISA 法在干预4、8、12 周后检测。

1.5.4 心功能指标情况

左室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)采用彩色多普勒超声诊断仪在干预4、8、12 周后检测。

1.5.5 肾小管损伤标志物水平

分别在干预4、8、12 周后,收集大鼠尿液,采用ELISA 法检测β2-MG 及RBP4 水平。以上操作均按照试剂盒标准严格进行。

1.6 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件处理数据,符合正态分布的计量资料用均数±标准差(±s)表示,3组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,不同时点计量资料采用重复测量方差分析,以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能指标水平比较

时点比较,干预4、8、12 周时3 组的24 h 尿蛋白、BUN 及Cr 水平差异均无统计学意义(P >0.05);组间比较,对照组24 h 尿蛋白、BUN 及Cr 水平低于DN +GBE 组(P<0.05),DN + GBE 组24 h 尿蛋白、BUN 及Cr水平低于DN组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点肾功能指标水平比较(±s)

表1 各组大鼠不同时间点肾功能指标水平比较(±s)

注:与对照组比较,aP <0.05;与DN组比较,bP <0.05;与干预4周比较,*P <0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点,P值F交互,P值F组间,P值n 12 12 12时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周24 h尿蛋白(mg/24 h)5.67±1.68 5.56±1.72 5.49±1.75 12.45±2.98a 14.78±3.09a 16.11±3.27a*9.71±2.30ab 8.42±2.26ab 7.89±2.12ab 3.527,0.069 30.375,0.000 54.078,0.000 BUN(mmol/L)9.12±2.66 9.64±2.56 9.02±2.58 23.45±6.45a 24.12±6.60a 25.68±6.85a 17.68±3.54ab 16.32±3.25ab 15.78±3.12ab 0.019,0.891 4.661,0.016 42.283,0.000 Cr(µmol/L)9.34±1.88 9.87±1.94 9.41±1.81 24.08±4.14a 26.54±4.26a 28.80±4.91a*22.10±3.44ab 20.12±3.56ab 17.78±3.68ab*0.088,0.769 24.391,0.000 111.504,0.000

2.2 炎性因子水平比较

时点比较,干预4、8、12周时3组的IL-6、TNF-α水平差异均无统计学意义(P >0.05);组间比较,对照组IL-6、TNF-α 水平低于DN + GBE 组(P<0.05),DN + GBE 组IL-6、TNF-α 水平低于DN 组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点炎性因子水平比较(±s,n=12)

表2 各组大鼠不同时间点炎性因子水平比较(±s,n=12)

注:与对照组比较,aP <0.05;与DN 组比较,bP <0.05;与干预4 周比较,*P <0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点,P值F交互,P值F组间,P值时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周IL-6(µg/L)3.02±0.29 3.16±0.36 3.21±0.38 15.12±2.68a 16.89±2.82a 18.71±2.94a*9.62±3.13ab 8.42±3.04ab 7.89±2.96ab 2.406,0.130 12.469,0.000 144.474,0.000 TNF-α(mg/L)2.45±0.45 2.67±0.39 2.56±0.48 9.45±2.28a 9.86±2.14a 10.32±2.09a 6.12±1.56ab 5.28±1.46ab 4.68±1.32ab*0.416,0.523 8.178,0.001 96.238,0.000

2.3 心功能指标比较

时点比较,干预4、8、12周时3组的LVEF、LVFS值差异均无统计学意义(P >0.05);组间比较,对照组LVEF、LVFS 值高于DN + GBE 组(P<0.05),DN +GBE 组LVEF、LVFS 值高于DN 组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠不同时间点心功能比较(±s,n=12)

表3 各组大鼠不同时间点心功能比较(±s,n=12)

注:与对照组比较,aP <0.05;与DN组比较,bP <0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点,P值F交互,P值F组间,P值时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周LVEF(%)82.67±3.45 82.12±3.67 82.73±3.94 71.24±5.72a 70.68±5.84a 70.79±5.84a 77.95±3.47ab 76.42±3.14ab 78.12±3.24ab 0.019,0.890 0.130,0.878 26.900,0.000 LVFS(%)47.66±3.98 47.12±4.06 47.05±4.11 36.89±4.42a 36.95±4.08a 36.13±4.16a 41.22±3.30ab 41.08±3.40ab 42.45±3.24ab 0.008,0.928 1.543,0.229 29.270,0.000

2.4 β2-MG及RBP4水平比较

时点比较,干预4、8、12 周时3 组的β2-MG 差异均具有统计学意义(P<0.05),RBP4 水平差异无统计学意义(P >0.05);组间比较,对照组β2-MG、RBP4水平低于DN + GBE 组(P<0.05),DN + GBE 组β2-MG、RBP4水平低于DN组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠不同时间点β2-MG及RBP4水平比较(±s,n=12)

表4 各组大鼠不同时间点β2-MG及RBP4水平比较(±s,n=12)

注:与对照组比较,aP <0.05;与DN 组比较,bP <0.05;与干预4 周比较,*P <0.05。

组别对照组DN组DN+GBE组F时点,P值F交互,P值F组间,P值时间干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周干预4周干预8周干预12周β2-MG(mg/L)6.12±1.60 6.45±1.54 6.52±1.66 56.78±7.88a 28.32±7.96a 31.19±8.42a*20.96±5.09ab 18.45±5.21ab 16.08±5.15ab*155.440,0.000 97.323,0.000 157.309,0.000 RBP4(mg/L)10.88±2.96 11.42±3.12 11.73±3.09 27.78±5.42a 29.45±6.12a 31.66±6.65a 17.90±4.17ab 16.32±4.24ab 15.78±4.08ab 1.521,0.226 6.030,0.006 67.659,0.000

3 讨论

DN 为DM 患者常见并发症之一,近年来发病率逐年攀升。相关资料指出,DN是造成患者终末期肾病的重要原因,其地位仅次于肾小球肾炎,发生后可引起患者肾功能损伤,严重时可导致尿毒症,增加疾病病死率[7-8]。目前关于DN 的发病机制尚未完全明确,其早期主要表现为基底膜肥厚及肾血流增加,经进展可表现为蛋白排泄增加、肾小球硬化及肾脏炎症,造成肾功能障碍。既往研究发现,血糖、血脂、氧化应激反应等与DN的发生及发展密切相关,DN疾病初期,炎性细胞可在肾小球中积聚,可能参与DN 的发病过程[9-10]。故现阶段改善患者肾功能及心功能、降低炎症反应为DN治疗的关键点。银杏叶性味苦、涩、平,具有活血止痛及保护心脑血管等作用。银杏叶提取物为银杏叶中提取的有效成分,包含黄酮类、有机酸类及萜类内酯等活性成分,具有抗氧化应激、抗血小板、抑制肾小管细胞凋亡及改善微循环等作用[11]。有研究指出,银杏叶提取物可有效清除机体自由基,具有抑制毛细血管通透性,改善机体新陈代谢及末梢血液循环障碍等作用[12]。

高糖状态下,肾小球微循环受到损害,可激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统,进一步促进NO 的代谢,造成内源性血管舒张,损伤内皮细胞及肾小球[13]。据文献报道,肾小球肾病以蛋白尿增多及肾功能参数变化为主要特征,因此可升高BUN 及Cr 水平,降低肌酐清除率;且在炎症反应的刺激下,炎性因子聚集于肾小球及间质中,可加重DN 肾损伤[14]。庞欣欣等[15]研究发现,DN 患者微量蛋白尿升高之前,其肾小管损伤标志物会出现异常升高,提示DN 患者肾小管病变要早于肾小球损伤。基于这一结论,近年来较多研究者指出,除肾小球指标可较为准确预测DN 患者肾功能外,肾小管标志物对DN 肾功能预测的敏感性也较高。β2-MG 及RBP4 均为灵敏的肾小管损伤标志因子,其可从肾小球中自由滤过,且绝大部分在近端肾小管中被吸收,并在肾小管上皮细胞中分解破坏,因此正常情况下β2-MG 的排出量较少。另有研究指出,β2-MG、RBP4 与DN 患者Cr 及尿微量白蛋白呈正相关。本研究中,干预4、8、12 周后对照组24 h 尿蛋白、BUN、Cr、β2-MG、RBP4 水平均低于低于DN + GBE 组,DN+GBE 组24 h 尿蛋白、BUN、Cr、β2-MG、RBP4 水平低于DN 组。提示GBE 可有效改善DN 模型大鼠肾功能,改善大鼠肾脏组织结构,降低细胞坏死及基底膜增厚,进而发挥肾脏的保护作用。

炎症因子在DN 发生中的作用机制已得到证实。IL-6 为机体促炎细胞因子,可刺激肝细胞合成,从而生成急性期蛋白,参与炎症反应。已有研究指出,IL-6 可促进机体白细胞吞噬能力的提高,进一步增加毛细血管通透性,进而造成微量白蛋白增高。IL-6还可降低胰岛β 细胞功能,降低胰岛素,促使DN 发生[16]。而hs-CRP 为急性反应蛋白,可引起机体氧化应激反应,损伤肾小球内皮细胞,并进一步导致动脉硬化,促进DN 形成。TNF-α 为DN 的重要介质,其水平可随DN 病程的延长而升高,并可促进胰岛素抵抗,造成机体氧化自由基反应,加重DN 患者肾功能损伤[17]。一项国外研究指出,IL-6、hs-CRP 与纤维蛋白原的关系密切[18]。本研究中,干预4、8、12 周后对照组IL-6、TNF-α 水平均低于低于DN+GBE 组,DN+GBE 组IL-6、TNF-α 水平低于DN 组。提示GBE 可有效改善DN模型大鼠炎性反应,在DN形成中具有抗炎作用。

DM 主要为胰岛素缺乏、生物活性受损及代谢紊乱引起,可造成心血管、肾脏及神经等一系列组织损害。DN 为DM 的严重并发症,若未及时进行有效治疗,可并发尿毒症,增加死亡风险。有研究指出,DM可引起心肌细胞凋亡,造成心肌顺应性改变,影响心功能,也可能参与DN 的发病过程[19]。本研究结果显示,DN + GBE 组LVEF、LVFS 值高于DN 组。证实GBE 组大鼠心室收缩功能显著改善,提示GBE 具有减少心肌细胞凋亡、改善大鼠心功能作用。

综上所述,银杏叶提取物可有效改善DN 大鼠肾功能及心功能,并减轻大鼠肾小管损伤,减少炎症因子释放。

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