清肠化湿方通过影响IDO1调节Th17/Treg细胞因子表达平衡治疗溃疡性结肠炎

周恩，朱磊，沈洪

（南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种持续时间较长的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其临床特征包括腹泻、腹痛和便血，病理特征包括连续和弥漫性肠黏膜损伤，涉及结肠或直肠的黏膜和黏膜下层［1］。UC 作为难治性终身性疾病，发病率逐年升高。遗传、环境、免疫、肠道菌群等多种因素综合作用是UC 发病的主要机制。研究显示，宿主与肠道菌群之间的相互作用会诱导机体产生适应性免疫应答［2］，Th17/Treg 细胞因子表达平衡一旦被打破，便会诱发一系列免疫炎症反应，参与UC 发病及进展的全过程。吲哚胺2，3-双加氧酶1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1）作为主要限速酶参与色氨酸沿犬尿氨酸途径的分解代谢，IDO1是在炎症条件下诱导的色氨酸分解代谢酶，可能与体内平衡最相关［3］，有助于免疫反应［4］。因此，IDO1 可能是一个重要的分子标记［5-6］。大量研究表明，IDO1 在炎症性肠病、感染和憩室病中的表达增加［7-8］。通过生物信息学分析也证实了IDO1 在UC中上调，主要与细胞因子分泌、免疫反应和癌症进展有关，其表达也在UC小鼠模型中得到证实［3］。

清肠化湿方是沈洪教授根据多年临床经验、前期课题、实验等相关研究优化精简而来，由黄芪、白芍、地榆、白头翁、白芷、黄芩等6 味药组成，具有清热除湿、调和气血、凉血止痢之效。课题组前期研究表明，清肠化湿方能够修复UC 小鼠受损肠道黏膜，减轻炎症反应，其机制可能与调节肠道菌群有关［9］。

因此，本研究通过葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，以期能够发现Th17/Treg 细胞因子表达平衡与IDO1 的联系，进一步探讨清肠化湿方治疗UC的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

健康SPF 级C57BL6/J 小鼠，雄性，6～8 周龄，体质量18～20 g，购于浙江维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：20210526Abzz0619000328，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001。于南京中医药大学动物实验中心动物房饲养，温度24～25 ℃，湿度50%～60%，光照时间：每日12 h 光照，12 h 避光。小鼠被允许自由采食和饮水。实验前，小鼠至少适应新环境7 d。

1.2 药物制备

组方：生黄芪15 g，炒白芍15 g，生地榆15 g，白头翁15 g，白芷10 g，黄芩10 g，共80 g/剂，药物饮片购于江苏省中医院。称取清肠化湿方药物，加10 倍水浸泡1 h 后煎煮2 次，合并2 次药液，旋转蒸发浓缩，制备成浓度为1.2、2.4 g/mL的清肠化湿方水煎液。

1.3 药物及试剂

葡聚糖硫酸钠（DSS，M.W.= 36 000，50 000，CAS：9011-18-1）（美国MP Biomedicals 公司）；HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（货号：R323-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；RNA 抽提液TRIZOL REAGENT［货号：15596018，英潍捷基（上海）贸易有限公司］；ChamQ SYBR qPCR Master Mix（货号：Q711-02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；引物合成于上海捷瑞生物工程有限公司；BCA蛋白测定试剂盒（货号：E112-01/02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；预染蛋白Marker［货号：26617，英潍捷基（上海）贸易有限公司］；ECL化学发光液（货号：E412-02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；抗体IDO1（Proteintech）（货号：13268-1-AP，南京伟沃生物科技有限公司）；抗体RORγt（Proteintech）（货号：13205-1-AP，南京伟沃生物科技有限公司）；抗体Foxp3（Proteintech）（货号：22228-1-AP，南京伟沃生物科技有限公司）；内参GAPDH（货号：bsm-33033 m，北京博奥森生物技术有限公司）；HRP 标记山羊抗小鼠（货号：GB23301，武汉赛维尔生物科技有限公司）；HRP 标记山羊抗兔（货号：GB23303，武汉赛维尔生物科技有限公司）；4%的多聚甲醛固定液（货号：G1101，武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.4 仪器

倒置显微镜（型号：CKX41，日本Olympus 公司）；PCR 仪（型号：EasyCycler，德国analytikjena）；超微量分光光度计（型号：NANODROP 2000，美国Thermo）；实时荧光定量PCR 仪（型号：LightCycler96，瑞士Roche）；电泳仪（型号：PowerPac Basic，美国Bio-Rad公司）；凝胶成像仪（型号：CHEMIDOC XRS+，美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 UC模型建立、分组及给药

将24只小鼠适应性饲养2周后，随机分为空白组、模型组、清肠化湿方低剂量组和清肠化湿方高剂量组，每组6只。实验第1～13天，空白组小鼠自由饮用纯水作为对照，模型组给予0.2 mL/20 g 纯水灌胃，清肠化湿方低剂量组［12 g/（kg·d）］、清肠化湿方高剂量组［24 g/（kg·d）］分别予相应浓度中药按0.2 mL/20 g 灌胃，实验第4～10 天模型组、清肠化湿方低剂量组、清肠化湿方高剂量组自由饮用2.5% DSS 以制备结肠炎模型。

2.2 取材

第14 天处死小鼠，用镊子摘取一侧眼球，取血，6 000 r/min，离心10 min，吸取上层血清，-80 ℃保存，备用。剖开小鼠腹部，充分暴露腹腔，取肛门上2 cm至盲肠的整段结肠，选取0.5 cm 结肠组织用4%多聚甲醛固定，用于HE 染色，余结肠组织放于-80 ℃备用。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 小鼠一般情况、疾病活动指数评分（DAI）及结肠长度

实验过程中，每天观察小鼠毛色、精神状态等一般情况，每天记录小鼠体质量、粪便性状、便血情况，进行小鼠疾病活动指数评分（disease active index，DAI）。具体见表1。此外，实验第14 天，剖取结肠后，用尺子量取结肠长度，以初步评价药物治疗UC的疗效。

表1 小鼠DAI评分标准

DAI=（体质量下降/%+大便性状+血便）/3

2.3.2 小鼠结肠组织病理学检测

造模给药后，于第14 天处死小鼠，留取0.5 cm 小鼠结肠组织于4%福尔马林中固定，常规石蜡包埋，切片约4～5µm，行常规HE染色，光镜观察。

2.3.3 RT-qPCR 检测结肠组织RORγt、IL-17、IL-22、IL-23、Foxp3、IL-10、TGF-β、IDO1 mRNA表达水平

每组选15 mg结肠组织，匀浆，用Trizol试剂提取总RNA，逆转录成cDNA。PCR 反应体系：cDNA 1µL，上下游引物反应体系各1µL，DEPC 水4.5µL，2×ChamQ SYBR Qpcr Master Mix 7.5 µL。PCR 反应程序：预变性：95 ℃30 s，进行1 个循环；退火：95 ℃10 s；60 ℃30 s，进行40 个循环；溶解曲线：95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。按照2-△△Ct计算得到相对定量结果。引物序列参照Gene Bank 数据库中的基因序列，引物合成于上海捷瑞生物工程有限公司。引物序列见表2。

2.3.4 Western Blot 法检测结肠组织RORγt、Foxp3、IDO1蛋白表达水平

取15 mg 组织放入匀浆管，加入200 µL 含PMSF的裂解液，匀浆，置于冰上，裂解30 min；BCA 法定蛋白，算出蛋白上样量；12%分离胶加3%浓缩胶；电泳（浓缩胶电压70 V 压胶，待跑至分离胶处电压调至110 V，条带跑至底部即停止）；湿转，恒压100 V，60 min；转膜后的PVDF 膜置于5%脱脂牛奶室温封闭90 min，50 r/min；孵育一抗（1∶1 000），置于摇床4 ℃，50 r/min过夜。次日，TBST洗膜3次，100 r/min，15 min/次；孵育二抗（1∶3 000），室温孵育1 h，转速50 r/min；TBST洗膜3 次，100 r/min，15 min/次，显影。采用ECL 液进行发光及条带分析。

2.4 统计学方法

实验中的数据采用Graphpad Prism8.0 软件进行统计处理，数据先进行正态分布和方差齐性检验，若符合正态分布及方差齐性检验，进行one-way ANOVA分析；若不符合正态分布，选择非参数检验；数据用±SEM表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠一般情况

实验结束后，空白组小鼠一般状况良好，毛色正常，精神活跃，饮食及二便正常；模型组小鼠在给予2.5%DSS后，体质量下降明显，精神渐萎靡，毛发无光泽，饮食摄入明显减少，出现明显的稀便和肉眼血便；清肠化湿方低剂量组小鼠体质量下降与模型组相似，精神稍萎靡，饮食摄入减少，出现稀便及肉眼血便，但较模型组少；清肠化湿方高剂量组小鼠体质量下降不显，精神状态可，毛发光泽，大便增粗，出现较少稀便及肉眼血便。

3.2 各组小鼠第13 天DAI 评分及各组小鼠平均结肠长度比较

与空白组比较，模型组小鼠DAI 评分升高（P＜0.01），结肠长度缩短（P＜0.000 1）。与模型组相比，清肠化湿方低剂量组DAI评分降低，结肠长度增加，但无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，清肠化湿方高剂量组DAI 评分明显降低（P＜0.05），结肠长度明显增加（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠第13天DAI评分及结肠长度（±SEM）

表3 各组小鼠第13天DAI评分及结肠长度（±SEM）

注：与空白组相比，##P ＜0.01，####P ＜0.000 1；与模型组相比，*P ＜0.05。

组别空白组模型组清肠化湿方低剂量组清肠化湿方高剂量组n6 6 6 6 DAI评分（分）0.000±0.000 3.500±0.500##1.889±0.729 0.833±0.601*平均结肠长度（cm）7.800±0.157 5.433±0.112####6.350±0.154 6.883±0.176*

3.3 各组小鼠结肠组织病理情况

对各组小鼠结肠组织进行HE 染色，结果显示，空白组小鼠结肠结构完整，隐窝结构完整，无溃疡形成，未见炎性细胞浸润；模型组小鼠可见大片黏膜上皮破坏，隐窝结构破坏，溃疡形成，黏膜及黏膜下层大量炎性细胞浸润；清肠化湿方低剂量组杯状细胞和隐窝部分存在，但黏膜层较多炎症细胞浸润。清肠化湿方高剂量组，炎性细胞浸润减少，黏膜损伤较少，结构趋于正常，提示清肠化湿方低、高剂量组均能够减轻结肠炎症，减轻结肠组织损伤，但高剂量组效果更好。见图1。

3.4 各组小鼠结肠组织mRNA表达情况

3.4.1 清肠化湿方对UC 小鼠肠道RORγt 及相关细胞因子IL-17、IL-22、IL-23 mRNA表达的影响

与空白组相比，模型组UC 小鼠RORγt、IL-17、IL-22、IL-23 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，清肠化湿方低剂量组IL-17、IL-22、IL-23 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。与模型组相比，清肠化湿方高剂量组RORγt、IL-17、IL-22、IL-23mRNA 表达水平下降趋势明显（P＜0.01，P＜0.001）。见表4。

表4 各组小鼠结肠组织RORγt、IL-23、IL-17、IL-22 mRNA表达的比较（±SEM）

表4 各组小鼠结肠组织RORγt、IL-23、IL-17、IL-22 mRNA表达的比较（±SEM）

注：与空白组相比，##P ＜0.01；与模型组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

组别空白组模型组清肠化湿方低剂量组清肠化湿方高剂量组n4 4 4 4 RORγt 1.014±0.095 2.300±0.349##2.000±0.149 0.793±0.050***IL-17 1.275±0.549 12.276±3.305##4.160±0.423*2.794±0.366**IL-22 1.136±0.261 30.495±7.669##9.465±1.530*6.620±1.362**IL-23 1.051±0.187 13.006±3.645##4.647±0.728*2.258±0.308**

3.4.2 清肠化湿方对UC 小鼠肠道Foxp3 及相关细胞因子IL-10、TGF-β mRNA影响

与空白组相比，模型组UC 小鼠Foxp3 mRNA 表达降低，清肠化湿方低剂量组IL-10、TGF-β mRNA 水平升高（P＜0.01，P＜0.001）。与模型组相比，清肠化湿方高剂量组Foxp3、IL-10、TGF-β mRNA 表达水平升高明显（P＜0.05，P＜0.01）。见表5。

表5 各组小鼠结肠组织Foxp3、IL-10、TGF-β mRNA表达的比较（±SEM，n=4）

表5 各组小鼠结肠组织Foxp3、IL-10、TGF-β mRNA表达的比较（±SEM，n=4）

注：与空白组相比，##P ＜0.01，###P ＜0.001；与模型组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别空白组模型组清肠化湿方低剂量组清肠化湿方高剂量组Foxp3 1.029±0.143 0.348±0.116 1.469±0.602 1.963±0.331*IL-10 1.138±0.347 3.402±0.467 2.068±0.144###11.949±2.699**TGF-β 1.001±0.025 1.950±0.077 1.479±0.146##6.196±1.468**

3.4.3 清肠化湿方对UC小鼠肠道IDO1 mRNA影响

与空白组相比，模型组UC 小鼠IDO1 mRNA 表达显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，清肠化湿方低剂量组IDO1 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。与模型组相比，清肠化湿方高剂量组IDO1 mRNA 表达下降明显（P＜0.01）。见表6。

表6 各组小鼠结肠组织IDO1 mRNA表达的比较（±SEM）

表6 各组小鼠结肠组织IDO1 mRNA表达的比较（±SEM）

注：与空白组相比，##P ＜0.01；与模型组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别空白组模型组清肠化湿方低剂量组清肠化湿方高剂量组n4 4 4 4 IDO1 1.051±0.192 5.916±1.595##1.355±0.451*1.107±0.246**

3.5 清肠化湿方对UC 小鼠肠道RORγt、Foxp3、IDO1蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组UC小鼠结肠组织RORγt蛋白表达增加。与模型组相比，清肠化湿方低剂量组及高剂量组RORγt 蛋白表达降低（P＜0.05）。与空白组相比，模型组小鼠结肠组织Foxp3 蛋白表达降低明显。与模型组相比，清肠化湿方低剂量组Foxp3蛋白表达升高，高剂量组Foxp3蛋白表达升高明显（P＜0.05）。与空白组相比，模型组结肠组织中IDO1蛋白表达显著升高。与模型组相比，清肠化湿方低剂量组IDO1蛋白表达水平降低，清肠化湿方高剂量组IDO1蛋白表达水平降低明显（P＜0.05）。见图2、图3和表7。

表7 RORγt、Foxp3、IDO1蛋白相对表达量（±SEM，n=6）

表7 RORγt、Foxp3、IDO1蛋白相对表达量（±SEM，n=6）

注：与模型组相比，*P ＜0.05。

组别空白组模型组清肠化湿方低剂量组清肠化湿方高剂量组RORγt/GAPDH 0.685±0.034 0.763±0.044 0.564±0.026*0.565±0.051*Foxp3/GAPDH 0.835±0.034 0.669±0.062 0.973±0.078 1.165±0.117*IDO1/GAPDH 0.212±0.056 0.407±0.106 0.165±0.044 0.064±0.025*

4 讨论

UC 作为临床难治性疾病之一，我国UC 的发病率呈快速上升趋势［10-11］。根据其临床特点，将其归属于“久痢”“肠澼”“泄泻”“便血”等范畴，病机多为湿热蕴肠、气血失调［12］。清肠化湿方集“白头翁汤”“芍药汤”“黄芩汤”于一体，方中白头翁清热止痢、解毒凉血，白芍健脾柔肝、调气和血，黄芩清肠化湿、止痢凉血，白芷排脓消肿，地榆敛疮凉血，黄芪益气健脾，共奏清热除湿、调和气血、止痢凉血之效［13］。

目前，UC 的病因尚不清楚，但多项研究显示，UC的发病与免疫失调相关［14-16］。在UC 的发展过程中，Th17 细胞的数量通常会增加，而Treg 细胞的数量会减少，因此，结肠固有层中的CD4+T细胞常被认为是溃疡性结肠炎发病的关键因素［1］。Th17 细胞作为CD4+T 细胞亚群，不仅可以通过保持免疫微环境的平衡来保护肠黏膜，还可以通过促炎细胞因子IL-17、IL-22 和IL-23等加剧肠道炎症反应［14］。RORγt是Th17特有的转录因子，其表达控制Th17细胞的分化及功能变化［17］。Treg细胞是CD4+T细胞的另一个亚群，发挥负免疫调节作用，主要通过分泌抗炎细胞因子，如TGF-β 和IL-10，抑制免疫细胞的活性，从而控制炎症，参与各种免疫疾病［18］，维持免疫耐受和平衡［14］。Foxp3 是Treg关键转录因子，控制Treg细胞的发育和功能，其表达水平对于Treg 的功能变化有直接影响［19］。Th17 细胞促进组织炎症，Treg细胞抑制自身免疫。因此，Th17/Treg细胞平衡至关重要。本研究发现，模型组UC 小鼠结肠中RORγt，及相关促炎因子IL-17、IL-22、IL-23 mRNA 表达升高，Foxp3 mRNA 表达下降，同时通过Western Blot 验证了在模型组小鼠结肠组织中RORγt 蛋白表达升高，Foxp3 蛋白表达下降，提示抑炎因子降低而促炎因子升高，说明Th17/Treg 平衡被打破，Th17/Treg 及相关细胞因子对维持UC 免疫耐受和平衡密切相关。与模型组比较，清肠化湿方低、高剂量组均降低了RORγt 及相关促炎因子IL-17、IL-22、IL-23 mRNA 表达情况，但尤以清肠化湿方高剂量组下调明显。与模型组比较，清肠化湿方高剂量组显著上调了Foxp3 及抑炎因子IL-10、TGF-β mRNA 表达，清肠化湿方低剂量组上调不明显。同时与模型组相比，清肠化湿方低剂量组Foxp3 蛋白表达升高，RORγt 蛋白下降。与模型组相比，清肠化湿方高剂量组能有效降低UC 小鼠结肠组织RORγt 蛋白表达情况，升高Foxp3 蛋白表达，提示清肠化湿方能够有效激活UC 小鼠的Treg 细胞，抑制Th17 细胞，从而改善Th17/Treg 细胞因子表达平衡，抑制炎症免疫反应，其中尤以清肠化湿方高剂量组效果显著。

IDO1是一种由先天免疫系统细胞表达的酶，充当与适应性免疫系统的界面［20］。通过色氨酸的分解代谢和犬尿氨酸代谢产物的产生，IDO1在黏膜免疫耐受中发挥重要作用［21］。IDO1 是Treg 细胞分化的促成因素之一［22］。这种酶对调节免疫反应至关重要［23］。本实验发现，模型组小鼠结肠组织中IDO1 mRNA 表达水平升高，清肠化湿方低、高剂量组IDO1 mRNA 表达水平较模型组降低；模型组UC 小鼠IDO1 蛋白表达水平显著升高，清肠化湿方低剂量组IDO1蛋白表达水平较模型组降低，清肠化湿方高剂量组IDO1蛋白表达水平较模型组明显降低，表明IDO1 的激活与UC 的发生发展密切相关，而清肠化湿方能够明显下调UC 小鼠结肠组织中的IDO1 mRNA水平及蛋白表达水平。

综上所述，清肠化湿方能促进UC 小鼠恢复，降低UC 小鼠DAI 评分，改善病理损伤，尤以清肠化湿方高剂量组治疗作用显著，其作用机制可能是通过下调IDO1表达，下调RORγt及相关促炎因子IL-17、IL-22和IL-23，上调Foxp3及相关抑炎因子IL-10、TGF-β，维持Th17/Treg 细胞因子表达平衡，从而达到治疗作用。本次研究也存在不足之处，如相关研究显示犬尿氨酸/色氨酸是肠道中IDO1 激活的指标［24］，因此，本研究还应当评估各组小鼠血浆中犬尿氨酸及色氨酸浓度，以进一步证明IDO1被激活等。