白藜芦醇通过circACTR2/miR-186-5p对高糖诱导的视网膜血管内皮细胞损伤的影响

刘 珣，李 丹，王海凤，杨蕙頔

糖尿病视网膜病变是导致失明的主要原因之一，炎症、氧化应激和长期暴露于高血糖与游离氧自由基产生之间复杂的相互作用决定了糖尿病视网膜病变的发展[1-2]。白藜芦醇可减轻糖尿病视网膜病变和神经病变[3]。有研究报道，白藜芦醇能够通过激活SIRT1/AMPK/NF-κB通路来逆转高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(hRMEC)炎症“代谢记忆”[4-6]，但其对糖尿病视网膜病变影响的分子机制尚未完全清楚。有研究报道，沉默circACTR2抑制了高糖诱导的人肾系膜细胞增殖、炎症、细胞外基质积累和氧化应激[7]。生物学软件预测显示，circACTR2与miR-186-5p有结合位点。miR-186-5p可抑制高糖诱导的AC16心肌细胞损伤[8]。上调LncRNA OIP5-AS1通过海绵miR-186-5p保护神经元损伤免受氧糖剥夺/再氧诱导的氧化应激[9]。然而circACTR2和miR-186-5p对高糖诱导的hRMEC损伤的影响尚不清楚。本实验旨在研究白藜芦醇抑制高糖诱导的hRMEC损伤的分子机制是否与circACTR2和miR-186-5p有关。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 hRMEC(美国ATCC)；DMEM培养基、葡萄糖(美国Sigma公司)；白藜芦醇(纯度≥98%，上海宝曼生物科技有限公司)；凋亡检测试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；Trizol试剂、荧光定量PCR试剂盒(日本Takara)；超氧化物歧化酶(SOD)活性、乳酸脱氢酶(LDH)水平、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海李记生物科技有限公司)。

1.2细胞处理与分组 将hRMEC分别用含5.5、30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养，记为正常对照(NG)组、高糖(HG)组；分别用25、50、100 μmol/L白藜芦醇和30 mmol/L葡萄糖处理，记为HG+白藜芦醇低、中、高剂量组；将si-NC、si-circACTR2转染至hRMEC后用30 mmol/L葡萄糖处理，记为HG+si-NC组、HG+si-circACTR2组；将pcDNA、pcDNA-circACTR2转染至hRMEC后用100 μmol/L白藜芦醇和30 mmol/L葡萄糖处理，记为HG+白藜芦醇+pcDNA组、HG+白藜芦醇+pcDNA-circACTR2组。

1.3流式细胞术检测细胞凋亡情况 收集“1.2”中各组细胞，用预冷的PBS漂洗2次，与500 μl的结合缓冲液混匀；加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混匀后避光孵育10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SOD活性、LDH水平和MDA含量 收集“1.2”中各组细胞及上清液，分别按照试剂盒说明书检测细胞中SOD活性和MDA含量及细胞培养液中LDH水平。

1.5RT-qPCR检测circACTR2和miR-186-5p的表达水平 提取“1.2”中各组细胞总RNA，合成cDNA后进行PCR，circACTR2和miR-186-5p相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.6双荧光素酶报告实验 将circACTR2野生型和突变型荧光素酶载体分别与miR-NC和miR-186-5p共转染至hRMEC中，按照说明书检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1白藜芦醇对高糖诱导hRMEC损伤的影响 与NG组比，HG组hRMEC凋亡率升高，SOD活性降低，LDH水平和MDA含量升高(P<0.05)；与HG组比，HG+白藜芦醇低、中、高剂量组hRMEC凋亡率降低，SOD活性升高，LDH水平和MDA含量降低，呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1、表1。

图1 5组hRMEC凋亡情况流式细胞图

表1 5组hRMEC凋亡情况及氧化应激指标水平比较

2.2白藜芦醇对高糖诱导的hRMEC中circACTR2和miR-186-5p表达的影响 与NG组比较，HG组circACTR2表达水平升高，miR-186-5p表达水平降低(P<0.05)；与HG组比较，HG+白藜芦醇低、中、高剂量组circACTR2表达水平降低，miR-186-5p表达水平升高，呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 5组hRMEC中circACTR2和miR-186-5p表达水平比较

2.3circACTR2和miR-186-5p靶向关系验证 starbase预测显示circACTR2和miR-186-5p有互补序列。miR-186-5p与WT-circACTR2共转染后hRMEC细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)，见表3。si-NC组、si-circACTR2组miR-186-5p表达水平分别为1.00±0.00、3.78±0.15，si-circACTR2组miR-186-5p表达水平高于si-NC组(P<0.05)；pcDNA组、pcDNA-circACTR2组miR-186-5p表达水平分别为1.00±0.00、0.36±0.04，pcDNA-circACTR2组miR-186-5p表达水平低于pcDNA组(P<0.05)。

表3 miR-186-5p与WT-circACTR2共转染后hRMEC细胞荧光素酶活性比较

2.4沉默circACTR2对高糖诱导的hRMEC损伤的影响 与HG+si-NC组比较，HG+si-circACTR2组circACTR2表达水平和细胞凋亡率降低，SOD活性升高，LDH水平和MDA含量降低(P<0.05)。见图2、表4。

表4 沉默circACTR2对hRMEC凋亡及氧化应激的影响

图2 沉默circACTR2抑制高糖诱导的hRMEC凋亡流式细胞图

2.5过表达circACTR2对白藜芦醇处理的高糖诱导的hRMEC损伤的影响 与HG+白藜芦醇+pcDNA组比较，HG+白藜芦醇+pcDNA-circACTR2组circACTR2表达水平和细胞凋亡率升高，SOD活性降低，LDH水平和MDA含量升高(P<0.05)。见图3、表5。

表5 过表达circACTR2可减弱白藜芦醇对高糖诱导的hRMEC凋亡和氧化应激反应

图3 过表达circACTR2可减弱白藜芦醇对高糖诱导hRMEC凋亡的作用

3 讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病的主要并发症之一，其受包括氧化应激在内的多种机制调控，中医药在该病治疗方面具有一定的优势[10-11]。白藜芦醇具有抗氧化、抗炎、降血糖等多种生物活性[12]。研究报道，白藜芦醇可能通过激活PCG-1a-TFAM信号通路改善高糖环境下hRMEC的线粒体功能[13]。白藜芦醇通过上调miR-26a改善高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤[14]。本实验用高糖作用hRMEC建立糖尿病视网膜病变损伤模型，用不同浓度白藜芦醇处理后，细胞凋亡率降低，SOD活性升高，LDH水平和MDA含量降低，呈浓度依赖性。提示白藜芦醇可剂量依赖性的抑制高糖诱导的hRMEC凋亡和氧化应激，与既往研究结果相符，表明白藜芦醇具有防治糖尿病视网膜病变的作用。

研究报道，敲低circACTR2可显著降低高糖诱导的近端肾小管细胞凋亡、炎症和纤维化[15]。本实验结果显示，高糖诱导的hRMEC中circACTR2表达水平升高，沉默circACTR2后，hRMEC凋亡率降低，SOD活性升高，LDH水平和MDA含量降低。提示沉默circACTR2可抑制高糖诱导的hRMEC凋亡和氧化应激。研究报道miR-186-5p上调可改善脊髓缺血再灌注损伤[16]。miR-186-5p上调减轻了缺氧诱导的血管内皮细胞损伤[17]。而本实验结果证实circACTR2靶向调控miR-186-5p，提示circACTR2可能通过调控miR-186-5p影响高糖诱导的hRMEC损伤。此外，本实验还发现白藜芦醇可降低circACTR2表达水平，提高miR-186-5p表达水平，而过表达circACTR2可减弱白藜芦醇对高糖诱导的hRMEC损伤的作用。

综上所述，白藜芦醇可通过调控circACTR2/miR-186-5p抑制高糖诱导的hRMEC损伤。