Nogo-B 与JCAD 诱导肝癌基因激活

郭阵雨，赵新军，2，马军仁

(1.伊犁师范大学新疆凝聚态相变与微结构实验室，伊宁 835000;2.伊犁师范大学 微纳电传感器技术与仿生器械实验室，伊宁 835000)

1 引 言

慢性肝脏炎症会诱发肝癌( HCC) ，例如: 如慢性乙型肝炎( HBV) 或丙型肝炎( HCV) 、非酒精性脂肪肝炎( NASH) 会导致肝炎转化为HCC.感染HBV 或HCV 病毒后会造成肝细胞基因改变，从而导致HCC 的发生发展.NASH 临床表现为代谢综合征，生物学和流行病学研究表明，NASH可进展为HCC 或其他晚期肝病［1，2］.

目前的研究已经发现，在NASH -HCC 转变过程中，脂肪变性发展和自噬功能降低均与NASH 有关［3-5］，炎症和内质网应激则会在很大程度上影响NASH 的发病.近年的研究［6］也初步确认了patatin - like phospholipase domain containing 3( PNPLA3) 基因、transmembrane 6 superfamily member 2( TM6SF2) 基因和其他致病基因的功能障碍与NASH 有关，尽管这些基因的功能尚未完全确定，但是发现其多态性与HCC 的发生有关.NASH 发病的多因素特征及其进展决定了脂肪变性微环境中NASH - HCC 发生的致病复杂性，Wolf 等人［7］通过基因敲除操作，研究了小鼠细胞的适应免疫性在NASH - HCC 转化过程中的作用，该研究表明抑制Th17 细胞分化或阻断IL -17A 信号传导可阻止NASH 和随后的HCC 发生.Yoshimoto 等人［8］的研究证明了肠道菌群在NASH进展中的重要作用，并发现衰老的肝星状细胞( HSC) 对于将脂肪变性肝细胞转化为恶性细胞是至关重要的.在NASH—肝癌的发展过程中，脂代谢异常是NASH 转变为肝癌的一个重要促成因素，脂质的分解不仅为细胞提供能量，而且还调节其他的细胞过程，如激活致癌信号通路.Zhu等人［9］研究发现，内质网定位蛋白Nogo -B 的缺失会减少原发HCC 中STAT3 的磷酸化，这样Nogo-B 可以通过调节IL -6/STAT3 信号影响HCC 的发生.最近，Tian 等人［10］的实验结果表明，在NASH 向HCC 转化过程中，Low density lipoprotein ( LDL) 蛋白先被氧化为oxidized low density lipoprotein ( oxLDL) ，oxLDL 会诱导Nogo-B 表达上调，进而提升Hippo 信号通路中Yes-associated protein ( YAP) 的活性，激活HCC 基因的表达.Ye 等人［11］的研究则发现，在NASH所致HCC 的进展过程中，冠状动脉疾病相关连接蛋白JCAD 通过抑制Hippo 信号通路中large tumor suppressor homolog 2 ( LATS2) 激酶，抑制YAP 蛋白磷酸化，促进NASH 发展为HCC.深刻理解NASH 诱发HCC 发生发展的信号通路特性，对于设计阻断NASH 诱发的HCC 治疗方案是非常必要的.在激活基因通路研究方面，之前的理论结果［12-16］已经定量揭示了肿瘤抑制的物理机制.在慢性NASH 微环境中，oxLDL 通过诱导Nogo-B 表达上调提高YAP 的活性，激活HCC 基因的表达［10］.同时，JCAD 通过抑制Hippo 信号通路中的LATS2 提升YAP 的活性，促进HCC 的发生发展［11］.与JCAD 调控效应相反，LATS2 则促进YAP 磷酸化，限制其活性，进而降低了connective tissue growth factor ( CTGF) 等增殖因子的表达，抑制HCC 细胞生长增殖［11，17］.那么，Nogo-B、JCAD 与LATS2 是如何协同调控NASH-HCC的发生发展，当前仍然没有深刻理解.

本文建立理论模型研究Nogo -B 诱导oxLDL降解，以及JCAD 与LATS2 相互作用调节YAP磷酸化，协同调控HCC 基因激活的动力学机制.分析Nogo - B 诱导的oxLDL 降解、JCAD 与LATS2 调节YAP 磷酸化，激活致癌因子的信号通路特性，进一步深刻揭示NASH 诱发HCC 的致癌机理.

2 理论模型

在NASH 所致的HCC 进展过程中，我们考虑: (1) Nogo-B 通过激活DoxLDL -Nogo -B -YAP 通路［12］，导致HCC 的发生发展; (2) JCAD与LATS2 相互作用，并抑制YAP 磷酸化，未被磷酸化的YAP 激活下游Hippo 信号通路中下游与肿瘤形成相关的基因，从而导致HCC 的发生发展.模型示意图为:

基于我们之前的研究［12］，Nogo -B 与Autophagy-related 5 gene ( ATG5) 相互作用形成复合体NA，进而促进oxLDL 降解产生讲解后的ox-LDL( DoxLDL).JCAD 与LATS2 相互作用，与JCAD 结合的LATS2 标记为BLATS2，JCAD 与BLATS2 作用形成的复合体为JB，形成NA 和JB的反应均为二级反应.JB 抑制YAP 磷酸化，增进YAP 活性，磷酸化的YAP 标记为pYAP.未与JCAD 结合的LATS2 标记为FLATS2，FLATS2 则促进YAP 磷酸化，抑制YAP 活性.基于Hill 动力学与Michaelis-Menten 方程［18，19］，可以获得各组分浓度随时间演化的动力学方程组为:

以上方程组中，C=［DoxLDL］+［oxLDL］，表示DoxLDL 和oxLDL 的总浓度.LATS2 激酶的总浓度为［LATS2］=［FLATS2］+［BLATS2］，方程(9) 中Hill 系数为n=3.累积的肝脏脂肪诱导JCAD 的表达，并与LATS2 相互作用抑制YAP 磷酸化，被磷酸化的YAP 会滞留在细胞质中，而未被磷酸化的YAP 则会转移到细胞核与TEAD 结合，激活下游的Hippo 信号通路中下游connective tissue growth factor ( CTGF) 、cysteine -rich 61 ( Cyr61) 、cyclin D1( CCND1) 和glioma -associated oncogene homologue( GLI -2) 等与细胞增殖和肿瘤形成相关的基因，从而导致HCC 的发生发展［11］.在这里我们考虑CTGF 代表CYR61、CCND1 和GLI-2 等与细胞增殖和肿瘤形成相关的基因.

3 结果与讨论

Tian 等人［10］的实验发现oxLDL 降解完成需要约5 ～10 小时，DoxLDL 通过oxLDL -Nogo -B-YAP 信号通路激活下游HCC 基因.Ye 等人的实验发现［15］JCAD 通过抑制LATS2 激酶活性提升YAP 激活促进NASH 进展为HCC.为了符合实验结果，取适当的参数值( 如表1 所示) ，可以考察分析Nogo-B 与JCAD 诱导肝癌基因激活通路的动力学特性.

表1 模型中的参数取值Table 1 Standard parameter values of the model

图2a 呈现了DoxLDL、oxLDL 随时间演化的动力学关系，以及［LPC］随［DoxLDL］的变化关系.从图2a 可以看出，DoxLDL 在短时间内很快升高到了一定的浓度值，并趋于稳定，［oxLDL］则在短时间内很快降低，并趋于较低稳定值不变.由此表明，在较短的时间内oxLDL 降解，产生了大量的DoxLDL，并且在10 小时后oxLDL 降解完成，DoxLDL 维持一定的恒定值( oxLDL 已经降解完成) 不变，进而促进 Lysophosphatidylcholine( LPC) 合成，激活大量Lysopho - sphatidic acid( LPA) ( 图1a 插图) ，启动下游信号通路.从图2b 中LPC 随DoxLDL 演化的函数关系可以看出，随着［DoxLDL］的增加，［LPC］首先缓慢增加，当［DoxLDL］增加到约14 nM ，也就是oxLDL 几乎完全降解时，［LPC］出现了急剧增长.图2b 中的插入图表明［LPC］经过约20 小时升到了较大的稳定值，并开始维持这一较高的浓度值不变，反映出DoxLDL 对LPC 合成调节的时滞性.这是由于，在随着oxLDL 降解使得DoxLDL 浓度升高，一定浓度的DoxLDL 才能对LPC 合成有显著的促进作用，致使LPC 的浓度经过约20 小时很快提升，并升高到了较大的浓度值.由此表明，ox-LDL 的降解到一定程度，降解的oxLDL 达到一定的浓度值，会很快激活大量下游激活因子( autotaxin( ATX) 、LPA 等) ，之后便会在很大程度上提高Hippo 信号通路中YAP 的活性，激活下游癌基因( CTGF 等) 的表达.oxLDL 在降解为DoxLDL的过程中，Nogo-B 起着重要的调控作用［10］，ox-LDL 通过CD36 大量摄入细胞内，诱导Nogo -B和CCAAT 增强子结合蛋白β ( CEBPβ) 表达上调( 如模型图1) ，在oxLDL 的降解过程中，Nogo -B 通过与ATG5 反应结合形成复合体NA，NA 调节oxLDL 的降解产生降解后的DoxLDL.另外，CEBPβ 能够增强Nogo-B 基因的转录活性，协同诱导Nogo - B 表达上调［20］.为了考察NA 促进oxLDL 的降解，以及于CEBPβ 协同诱导Nogo-B表达上调效应，可以考察Nogo -B 和复合体NA浓度随时间的演化.

图1 Nogo-B 与JCAD 诱导肝癌基因激活的模型示意图.Fig.1 Schematic depiction of the model of Nogo -B and JCAD inducing hepatocellular carcinoma gene activation.

图2 ［DoxLDL］、［oxLDL］随时间演化的动力学关系( a) ，以及［LPC］随［DoxLDL］的变化关系( b).Fig.2 Temporal evolutions of the levels of［DoxLDL］and［oxLDL］( a).The［LPC］as a function of［DoxLDL］( b).

图3a 和3b 显示了Nogo-B 与NA 浓度随时间演化的动力学关系.从图3a 可以看出，Nogo-B 经过约25 小时时间升高到了最大的浓度值，然后趋于稳定，由此表明，经过约25 小时Nogo-B的表达可以上调到最高水平，而后轻微减小并趋于稳定值不变.图3b 显示NA 经过约25 小时升高到了最大值，之后也呈现出最高表达水平而后趋于稳定值不变.比较图3a 中Nogo -B 的演化和图3b 中NA 的演化特性，可以发现，Nogo -B和NA 呈现了相似的随时间演化特性，但是NA演化幅值远大于Nogo -B 幅值.由此表明，Nogo-B 与ATG5 的结合反应决定着的NA 的合成，通过NA 的合成，ATG5 放大了Nogo -B 表达的信号，使得Nogo-B 的激活效应增强，很快提升了oxLDL 的降解( 图3b 插图) ，促进了大量的LPA 合成.这样，通过Nogo-B 增强LPA 的合成激活YAP; 当ATG5 敲减后，NA 的合成被限制.实验研究已经发现［10］，Nogo - B 的表达与LPA浓度密切相关，并且部分Nogo-B 通过LPA 介导的YAP 信号转导促进肿瘤发生.在这里，我们发现部分Nogo-B 通过与ATG5 合成NA，在很大程度上激活YAP 信号促进肿瘤进展.图3b 也显示了NA 浓度随时间演化出现了最大值，这是由于CEBPβ 增强了Nogo-B 的转录激活.

图3 ［Nogo-B］与［NA］随时间演化的动力学关系Fig.3 Temporal evolutions of the levels of［Nogo - B］and［NA］.

图4 呈现了［CEBPβ］随时间演化的动力学关系，以及［Nogo - B］随［CEBPβ］改变的函数关系.从图4a 可以看出，CEBPβ 极快地升高到了最大值，然后持续极短时间后急剧降低并趋于稳定.由此表明，CEBPβ 随时间演化的初始阶段呈现了脉冲式触发信号，增强了Nogo -B 的转录激活，提升了Nogo - B 表达水平.这种触发增强，是oxLDL 调节Nogo-B 激活的补充，CEBPβ通过短暂的触发信号促进Nogo -B 表达上调，与oxLDL 协同增强了oxLDL -Nogo -B -YAP 通路的激活.实验研究发现［7］，CEBPβ 的表达提升的同时也增强了Nogo-B 的表达，Nogo -B 的表达水平与CEBPβ 的表达呈正相关.如图4b 所示，［Nogo - B］随［CEBPβ］的增加始于近似的线性增长，表明了Nogo -B 表达与CEBPβ 表达的正相关性，以及高表达的Nogo - B 只需较短时间CEBPβ 的刺激.从图4b 还可以看出，当CEBPβ浓度开始减少时，Nogo -B 呈现了趋于不变的稳态，并且稳态范围较大，直至浓度从38 nM 减少到15 nM 以内，Nogo-B 几乎趋于不变.这进一步表明了，CEBPβ 通过触发短暂的激活信号，与oxLDL 协同激活了稳定的oxLDL-Nogo -B -YAP通路［10］.由此可以推断，CEBPβ 的敲减会在一定程度上阻碍oxLDL 诱导的Nogo-B 激活表达，从而影响YAP、CTGF 的激活表达水平.为了进一步确定YAP、CTGF 的激活表达对Nogo -B 的依赖性，可以考察［YAP］与［CTGF］随［Nogo -B］的变化关系.

图4 ［CEBPβ］随时间演化的动力学关系( a) ，以及［Nogo - B］随［CEBPβ］变化的函数关系( b).Fig.4 Temporal evolution of the level of ［CEBPβ］( a) ，and ［Nogo - B］as a function of［CEBPβ］( b).

图5 显示了［YAP］与［CTGF］随［Nogo -B］变化的函数关系，如图5 所示，［YAP］和［CTGF］随［Nogo - B］的增大而增加表明，Nogo-B 的激活表达促使了YAP 和CTGF 的表达上调.由此可以确定，YAP 和CTGF 的活性依赖于Nogo-B.Nogo -B 诱导oxLDL 降解提升了YAP表达水平，并激活下游CTGF 等基因表达.从图5 还可以看出，当Nogo -B 浓度增加到一定值，然后当Nogo-B 浓度再减小时，YAP 和CTGF 都呈现了趋于不变的稳态，由此进一步表明，Nogo-B 表达上调诱导的oxLDL 降解，激活了稳定的oxLDL-Nogo -B -YAP -CTGF 通路.因此可以推断，Nogo-B 高表达所调控的信号通路途径中，Hippo 信号传导在异位Nogo -B 激活表达后被高度激活，这与Tian 等人［10］的实验结果相符.Nogo-B 通过促进oxLDL 降解，提升下游LPC 表达水平，由此导致LPA 在Nogo-B 表达上调后会显著增加，LPA 已被证明可以调节Hippo 途径信号［10，22］.由于Nogo -B 通过提高LPA 表达水平来刺激YAP 活性，降低了YAP 的磷酸化，并增加了下游靶结缔组织生长因子( 例如CTGF 等) 的转录水平，因此，形成了基于Nogo -B 的稳定的信号通路.

图5 ［YAP］与［CTGF］随［Nogo -B］变化的函数关系.Fig.5 ［YAP］and［CTGF］as a function of［Nogo-B］

实验研究［11，22］也表明JCAD 与Hippo 信号通路中关键分子LATS2 激酶相互作用，抑制YAP磷酸化.去磷酸化后YAP 进入细胞核，与TEAD分子结合，激活下游细胞增殖及肿瘤形成的相关因子( CTGF 等)［23，24］.

图6 呈现了在不同 JCAD 浓度条件下，［CTGF］随时间演化的动力学关系.从图6 可以看出，［CTGF］随着时间演化，逐渐升到了较大的稳定值，表明CTGF 被激活并达到一定的表达水平.比较图中不同JCAD 浓度时的［CTGF］幅值，可以发现，［JCAD］=15 nM 时的［CTGF］幅值明显高于［JCAD］为5 nM 时的幅值，这表明，在较高的JCAD 浓度条件下对CTGF 的激活幅度，大于在低浓度下对CTGF 的激活幅度，并且，随着JCAD 浓度的增加，CTGF 增加到稳定值的时间变短.由此表明，JCAD 在较大程度上调控着CTGF 的激活速度与表达水平.这是由于JCAD 与LATS2 相互作用，增强了在Hippo 途径中YAP 去磷酸化的能力，进而上调了CTGF 等HCC 细胞增殖因子.然而，沉默的JCAD 会产生相反的效果，JCAD 的低水平表达则会降低与LATS2 的结合作用，使得LATS2 促使YAP 磷酸化的能力增强，抑制HCC 的生长增殖.实验研究发现［11，17］，在正常肝组织中，JCAD 一直维持低表达水平，在NASH-HCC 标本中JCAD 的表达水平明显偏高.因此，JCAD 的过表达促进了肿瘤的生长和增殖，表明了JCAD 在NASH 向HCC 过渡期间，激活Hippo 信号级联反应中的新作用.

图6 不同［JCAD］条件下，［CTGF］随时间演化的动力学关系.Fig.6 Temporal evolutions of the level of［CTGF］at different［JCAD］.

JCAD 通过与激酶LATS2 结合反应，调控YAP 的磷酸化.在Hippo 信号通路中，LATS2 是调控YAP 的磷酸化水平的另一个重要调节子，其功能与JCAD 相反［11］.为了进一步研究激酶LATS2 在Hippo 信号通路中抑制NASH 发展为HCC 中的作用，可以考察不同FLATS2 浓度条件下［CTGF］随时间的演化关系.

图7 显示了在不同FLATS2 浓度条件下，［CTGF］随时间演化的动力学关系.比较图中FLATS2 浓度在［FLATS2］=5 nM、［FLATS2］=10 nM 和［FLATS2］=15 nM 时的CTGF 浓度幅值，可以发现，［FLATS2］=15 nM 时的CTGF 幅值明显低于浓度为［FLATS2］=5 nM 时的幅值，这是由于随着FLATS2 的增加，FLATS2 对CTGF的抑制程度增加.与JCAD 调控效应相反，随着FLATS2 浓度的减少，CTGF 增加到稳定值的时间变短，浓度幅值变大.由此表明，较高浓度的FLATS2 则会较大程度地促进YAP 磷酸化，抑制YAP 活性，进而降低了CTGF 等增殖因子的表达水平，较为显著地抑制了HCC 细胞的生长增殖.因此可以得出，LATS2 确实可以充当Hippo 信号通路的下游调节因子，从而影响HCC 细胞的增殖.Ye 等人［11］的实验的确发现，在Hippo 信号通路中，LATS2 可以使YAP 磷酸化以抑制CTGF 等表达，进而抑制脂肪肝病诱导的HCC 发生发展.

图7 不同［FLATS2］条件下，［CTGF］随时间演化的动力学关系.Fig.7 Temporal evolutions of the level of［CTGF］at different［FLATS2］.

4 结 语

本文建立理论模型研究Nogo -B 与JCAD 诱导非酒精HCC 基因激活.理论模型考虑: ( 1)Nogo-B 通过激活DoxLDL - Nogo - B - YAP 通路［12］，促使HCC 发生发展; (2) JCAD 与LATS2相互作用抑制YAP 磷酸化，未被磷酸化的YAP激活Hippo 信号通路中下游与肿瘤形成相关的增殖因子，导致HCC 的发生发展.研究发现，ox-LDL 在很短的时间内降解，产生了大量降解后的DoxLDL，进而很快激活下游通路信号( LPC、ATX、LPA 等) ，在很大程度上提升了Hippo 信号通路中YAP 的活性，激活下游CTGF 等癌基因.通过分析Nogo-B 随时间演化的动力学特性，可以发现，Nogo - B 与ATG5 的结合反应放大了Nogo-B 表达信号，促进LPA 合成并激活YAP.作为oxLDL 激活Nogo -B 的补充，CEBPβ 呈现了脉冲式触发信号增强了Nogo -B 的激活表达，并促进oxLDL 迅速降解，协同增强了稳定的Dox-LDL-Nogo-B -YAP -CTGF 通路信号激活.另外，JCAD 蛋白可以与LATS2 相互作用，促使YAP 去磷酸化，去磷酸化的YAP 上调CTGF 等增殖因子，表明了较高浓度的JCAD 调控CTGF 表达水平提升.与JCAD 调控效应相反，FLATS2 通过抑制YAP 活性，降低CTGF 等增殖因子的表达水平.由此也表明了JCAD、LATS2 在NASH 向转变HCC 过程中，激活Hippo 信号通路的新作用.事实上，Nogo -B 可以诱导oxLDL 的自噬和降解［25］，在NASH-HCC 的转化过程中，脂肪变性发展和自噬功能降低均与NASH 有关［26，27］，炎症和内质网应激也会在很大程度上影响NASH 的发病［28］，Nogo-B 的缺失会减少原发性HCC 中STAT3 的磷酸化，这样Nogo -B 还可以通过调节IL-6/STAT3 信号影响HCC 的发生发展.病理研究数据表明，未折叠的蛋白质反应UPR( unfolded protein response) 激活，在促进非酒精性脂肪肝病发展为HCC 进程中也会起着很重要的作用［29-31］.本文中只考虑Nogo -B 与JCAD 诱导HCC 基因激活的一种致癌机制，理论结果符合实验［10，11］，表明了Nogo-B 表达上调，会在很大程度上促使HCC 发生发展，以及JCAD 蛋白与LATS2 激酶也在很大程度上调控CTGF 等HCC 细胞的增殖，进而调节癌基因表达通路的动力学行为.