★ 李养学 曾志浩 袁家鑫 李素梅 钟惠娴 黄华靖 江洁怡(1.广东省中医药工程技术研究院 广州 510095;2.广东省中医药研究开发重点实验室 广州 510095;.广州中医药大学 广州 51005;.中山大学新华学院 广州 510520)
芪丹滋肾颗粒是广东省第二中医院的验方,对慢性肾炎有较好的临床疗效。本制剂适用于脾肾两虚,尤其是气阴两虚导致的慢性肾小球肾炎,通过滋养脾肾、润养脾肾来治疗脾肾两虚之症。芪丹滋肾颗粒由黄芪、丹参、大黄炭、墨旱莲、熟地黄、白术、赤芍、当归、川芎、牡丹皮和炙甘草共十一味药组成,诸药合用,共奏益气补肾、活血化瘀、利水消肿的功效。方中黄芪为君药,有文献报道黄芪甲苷能镇痛抗氧化、保护脾肾,能有效降低血压[1],通常作为含黄芪复方中药制剂的指标成分作为质量标准参考[2]。丹参、大黄炭、墨旱莲、熟地黄为臣药,具有抗炎抑菌等作用[3-6],佐以白术、赤芍、当归、川芎和牡丹皮,具有抗氧化、镇痛抗炎等作用[7-11],炙甘草为使药,调和诸药。诸药合用共奏滋养脾肾、润养脾肾之功。
医院制剂由所属医院制备并仅于本院临床使用,没有统一的质量标准,而制剂品质关系到患者的生命安全和医院的正常运营[12],因此建立医院制剂的质量标准尤为重要。本试验采用TLC法对方中君药黄芪,臣药丹参、大黄炭和墨旱莲进行定性鉴别;HPLC-ELSD法对方中的黄芪甲苷进行定量测定,建立了芪丹滋肾颗粒的质量标准,对其质量控制提供科学依据,使其成为安全有效、稳定可控的中药制剂奠定基础。
1.1 仪器 薄层色谱自动点样仪(TLC SAMPLER 4,瑞士),薄层成像系统(REPROSTAR 3,瑞士);高效液相色谱仪(Agilent 1200,美国);超声波清洗器(KQ5200DE,昆山);电子分析天平(XS205DU,瑞士);超纯水机(Milli-Q A10,美国)。
1.2 试药 甲醇(MT)、乙酸乙酯(EAC)、正丁醇(NBA)等分析纯试剂购自广州化学试剂厂;乙腈(ACN)等色谱纯购自德国默克,液相用水为屈臣氏蒸馏水经纯水机制得的超纯水。
芪丹滋肾颗粒(批号:20190527、20190528、20190529)来源于广东省中医药工程技术研究院;黄芪甲苷对照品、黄芪、丹参、墨旱莲、大黄等对照药材(批号分别为:110781-201616、120974-201612、120923-201615、120958-201407、121249-201304)均购自中国食品药品检定研究院。
2.1 定性鉴别
2.1.1 黄芪的薄层鉴别 取芪丹滋肾颗粒,研细,取3 g,加入甲醇30 mL后进行30 min超声处理,滤纸滤过,滤液置水浴锅蒸干,用水20 mL少量多次将残渣溶解,水液两次用水饱和正丁醇溶液振摇提取,30 mL每次,收集正丁醇液,并用现配的氨试液分2次洗涤,30 mL每次,分取正丁醇液,置水浴蒸干,用1 mL甲醇使溶解,制成芪丹滋肾颗粒黄芪供试品溶液。取黄芪甲苷对照品1 mg,用1 mL甲醇溶解,作为对照品溶液。取黄芪对照药材1 g,加水50 mL,煮沸,文火保持30 min后快速过滤,滤液自“水液两次用水饱和正丁醇液振摇提取”起,同法制成黄芪对照药材溶液。再取已制备的黄芪阴性样品,同芪丹滋肾颗粒黄芪供试品溶液制备方法制成缺黄芪的阴性对照样品溶液。参照《中国药典》2015年版四部通则0502项下进行试验,吸取黄芪甲苷对照品溶液、黄芪对照药材溶液、供试品溶液及阴性对照样品溶液各2μL,用硅胶G薄层板点样,展开剂为正丁醇(NBA)-乙酸乙酯(EAC)-稀氨水(1→10)(4∶1∶5)10 ℃以下放置的上层溶液,双槽展开缸并用氨蒸汽饱和30 min后展开,取出,通风厨晾干,用10%硫酸乙醇溶液喷雾显色,并用105 ℃加热至薄层斑点显色清晰,置365 nm紫外光灯下检视。在与黄芪甲苷对照品及黄芪对照药材色谱相应的位置上,供试品有清晰的荧光斑点,并且黄芪阴性对照无干扰。见图1。
图1 黄芪薄层色谱图
2.1.2 丹参的薄层鉴别 取芪丹滋肾颗粒,研细,取3 g,加入甲醇30 mL后进行30 min超声处理,滤纸滤过,滤液置水浴锅蒸干,用水20 mL少量多次将残渣溶解,调节pH(稀盐酸)值至2~3,水液再两次用乙酸乙酯振摇提取,20 mL每次,收集乙酸乙酯液,置水浴蒸干,用1 mL甲醇使溶解,制成芪丹滋肾颗粒丹参供试品溶液。取丹参对照药材0.5 g,加水50 mL,煮沸,文火保持30 min后快速过滤,滤液自“调节pH(稀盐酸)值至2~3”起,同法制成丹参对照药材溶液。再取已制备的丹参阴性样品,同芪丹滋肾颗粒丹参供试品溶液制备方法制成缺丹参的阴性对照样品溶液。参照《中国药典》2015年版四部通则0502项下进行试验,吸取丹参对照药材溶液、供试品溶液及阴性对照样品溶液各5 μL,用硅胶G薄层板点样,展开剂为丙酮(DMK)-乙酸乙酯(EAC)-甲酸(FA)(2.5∶1∶0.4),双槽展开缸并用氨蒸汽饱和5 min后展开,取出,通风厨晾干,置365 nm紫外光灯下检视。丹参对照药材色谱相应的位置上,供试品有清晰的荧光斑点,并且丹参阴性对照无干扰。见图2。
图2 丹参薄层色谱图
2.1.3 墨旱莲、大黄炭的薄层鉴别 取芪丹滋肾颗粒,研细,取5 g,加入30 mL甲醇后进行30 min超声处理,滤纸滤过,滤液置水浴锅蒸干,用水20 mL少量多次将残渣溶解,水液两次用乙醚振摇提取,20 mL每次,收集乙醚液,通风厨挥干,用1 mL甲醇使溶解,制成芪丹滋肾颗粒墨旱莲、大黄炭供试品溶液。再取墨旱莲、大黄对照药材各0.5 g,分别煎煮,各加水50 mL,煮沸,文火保持30 min后快速过滤,滤液自“分两次用乙醚振摇提取”起,同法分别制成墨旱莲、大黄对照药材溶液。再分别取已制备的墨旱莲、大黄炭的阴性样品,同芪丹滋肾颗粒墨旱莲、大黄碳供试品溶液制备方法分别制成缺墨旱莲、大黄炭的阴性对照样品溶液。参照《中国药典》2015年版四部通则0502项下进行试验,吸取墨旱莲、大黄对照药材溶液、供试品溶液及阴性对照样品溶液各10 μL,用硅胶G薄层板点样,展开剂为石油醚I(PE I)-乙酸乙酯(EAC)-甲酸(FA)(9∶1∶0.1),双槽展开缸展开,取出,通风厨晾干,置365 nm紫外光灯下检视。墨旱莲、大黄对照药材色谱相应的位置上,供试品有明显相对应的黄绿色、橙色荧光斑点,并且墨旱莲、大黄碳阴性对照无干扰。见图3。
图3 墨旱莲薄层色谱图
2.2 黄芪甲苷含量测定
2.2.1 黄芪甲苷对照品溶液的制备 精密称定黄芪甲苷对照品25.50 mg,置25 mL棕色量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成0.993 48 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液。
2.2.2 芪丹滋肾颗粒供试品溶液的制备 将芪丹滋肾颗粒研细并过四号筛,取约4 g,置200 mL具塞锥形瓶中,精密称定,用单标移液管加甲醇100 mL,称定质量,超声处理30 min,放冷,用甲醇补回损失的质量,摇匀,用定量滤纸过滤,再用单标移液管量取续滤液50 mL于蒸发皿,水浴蒸干,用水20 mL少量多次将残渣溶解,水液四次用水饱和正丁醇液振摇提取,20 mL每次,收集正丁醇液,用氨试液两次洗涤,40 mL每次,分取正丁醇液,水浴蒸干,用甲醇少量多次使溶解,转移至5 mL量瓶,定容,摇匀,即得。
2.2.3 芪丹滋肾颗粒阴性对照溶液的制备 取已制备的芪丹滋肾颗粒黄芪阴性对照样品约4 g,置200 mL具塞锥形瓶中,同芪丹滋肾颗粒供试品溶液的制备方法制得黄芪阴性对照溶液。
2.2.4 色谱条件 色谱柱为Thermo ODS-2 HypersilTM C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-水(32∶68)为流动相;流速1.0 mL/min;色谱柱温度25 ℃;气流1.5 L/min;漂移管温度45 ℃;进样量20 μL。
2.2.5 阴性干扰试验 精密吸取供试品溶液、黄芪甲苷对照品溶液(298.044 μg/mL)和缺黄芪阴性对照溶液三种溶液各20 μL,分别注入色谱仪中。结果显示,芪丹滋肾颗粒供试品色谱中与黄芪甲苷对照品色谱相同保留时间均出现色谱峰,而缺黄芪阴性对照品溶液色谱峰与黄芪甲苷对照品色谱峰相同保留时间内未显示色谱峰,结果表明该色谱条件下测定黄芪甲苷的含量可靠。见图4。
图4 芪丹滋肾颗粒HPLC-ELSD图谱
2.2.6 线性关系考察 分别精密量取黄芪甲苷贮备溶液1、2、3、4、5、6 mL置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,得到浓度为每1 mL中分别含黄芪甲苷99.348、198.696、298.044、397.392、496.740、596.088 μg的对照品溶液。分别吸取上述不同浓度的对照品溶液20 μL,进行色谱测定,并以峰面积对数(Y)和进样量(X)进行回归,得标准曲线为Y= 1.626 5X+3.809 2(r=0.999 0);结果表明黄芪甲苷在1.986 96~11.921 76 μg范围内呈良好的线性关系。
2.2.7 精密度试验 取上述已制备的芪丹滋肾颗粒(批号:20190527)供试品溶液,按上述色谱条件重复6次进样并进行测定,测得峰面积对数RSD为0.63%,表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试 验取上述已制备的芪丹滋肾颗粒(批号:20190527)供试品溶液,按上述色谱条件重复进样测定,分别在0、1、2、3、4、5、10、18 h进行测定,测得峰面积对数RSD为0.65%,表明供试品溶液在18 h内稳定。
2.2.9 重复性试验 取芪丹滋肾颗粒(批号:20190527),分别取6份,按照上述供试品溶液制备方法分别制得供试品溶液。按上述色谱条件进样测定,测得峰面积对数RSD为1.04%,表明所建立的含量测定方法重复性较好。
2.2.10 加样回收试验 取上述已计算含量的芪丹滋肾颗粒9份,每份分别精密加入适量的黄芪甲苷对照品,按芪丹滋肾颗粒的制备与测定方法,进行计算。结果黄芪甲苷的平均回收率为100.14%。见表1。
表1 黄芪甲苷加样回收率测定结果(n=9)
2.2.11 含量测定 分别取3批芪丹滋肾颗粒(批号:20190527、20190528、20190529),各平行处理2份,按照芪丹滋肾颗粒供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件进行测定,分别计算得到每批芪丹滋肾颗粒样品中黄芪甲苷的含量。见表2。
表2 样品含量测定结果(n=2) mg/袋
中药制剂中的药味鉴别不同于单味药材鉴别,不少药味的成分会相互影响导致阴性干扰,如处方中的赤芍含有芍药苷,牡丹皮的有效成分也包括芍药苷[11],对于这种存在相互干扰的药味,可以采用双阴性鉴别;且在制备过程中成分的损失可能导致药典的薄层鉴别方法在该制剂中未必适用。虽然存在上述问题,薄层鉴别依旧是最经济、快速、便捷的鉴别方法。本试验对方中各药味进行薄层鉴别方法摸索,建立了方中黄芪、丹参、大黄炭和墨旱莲4味药材的薄层鉴别方法并进行方法学考察,发现所建立的方法便捷可行,而其余药味的鉴别有阴性干扰,故未列入标准。
黄芪含有多种三萜皂苷成分,黄芪甲苷为其中之一。有文献报道[13]比色法、荧光法、薄层色谱扫描法和液相色谱法常用于测定黄芪中黄芪甲苷的含量。在进行比色法测定时,黄芪甲苷会受到其他的三萜皂苷的影响,导致测定误差较大,不能准确测定含量;而使用荧光法进行测定,同样因为三萜皂苷类成分繁多且结构类似,分离难度大,易有干扰;薄层色谱扫描法虽然直观,但是预处理繁琐,结果容易受到外界因素的干扰;而液相色谱法可根据检测器类型分成多种方法,如紫外、质谱、蒸发光散射、电喷雾和脉冲安培等检测器。黄芪甲苷的紫外光谱吸收波长在200 nm左右有最大吸收,但是容易受杂质、溶剂和其他三萜皂苷成分干扰,需要进行繁杂的预处理排除干扰,并不符合质量标准要求的快捷准确。本试验采用的HPLC-ELSD法适用于检测没有紫外末端吸收的成分,灵敏度高、干扰少,符合质量控制的要求。
本研究所建立的质量控制方法稳定、可靠,重现性好,能较好地对芪丹滋肾颗粒进行定性、定量检测,可用于芪丹滋肾颗粒的质量控制。