pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ表达质粒的构建及鉴定*

周连仲 刘 冲 苏 玢 王明辉

天津市第四中心医院 南开大学附属第四中心医院 天津市耳鼻咽喉头颈外科医院 1 耳鼻咽喉头颈外科 2 麻醉科 300140

软骨调节素(ChM)是近年来新发现的一种软骨源性生长因子，分为ChM-Ⅰ、ChM-Ⅱ、ChM-Ⅲ三种，其中ChM-Ⅰ是ChM家族中效应最强的一种软骨特异性生长因子，它不仅是一种软骨细胞生长刺激因子，而且是一种血管内皮细胞生长抑制剂。Hiraki 等[1]发现ChM-Ⅰ在体外抑制血管内皮细胞的增殖和管状形态的形成，证明ChM-Ⅰ可维持软骨的无血管特征。其抑制血管内皮细胞增殖和管状形态的形成的作用已得到了实验的证明，对这一作用的产生机制也有相关的报道。 Hayami T等将人软骨肉瘤OUMS-27细胞植入裸鼠，在肿瘤组织中检测到大量的软骨基质[2]，植入30d后，发现肿瘤具有诱导血管形成的作用。局部应用重组的人ChM-Ⅰ后，几乎完全阻断血管长入和肿瘤生长。在体内ChM-Ⅰ同样抑制了HT-29结肠腺癌的生长。 李琪等人[3]用人重组的ChM-Ⅰ 蛋白治疗骨肉瘤也得到了同样的结果。提示在实体肿瘤的治疗过程中，ChM-Ⅰ抑制血管形成起了关键的作用。Mera H等人通过实验验证了ChM-Ⅰ除了有间接抑瘤作用外，还可直接的抑制肿瘤细胞的生长[4]。其直接抑瘤作用是通过抑制STAT的转录这一信号途径来实现的。这一发现为肿瘤治疗提供新的方向。本实验拟构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ 表达质粒，为研究ChM-Ⅰ的生物学作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 SD大鼠、XL1-Blue感受态菌、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(碧云天)、1%琼脂糖凝胶等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ChM-Ⅰ目的基因的获取。取大鼠软骨组织，通过液氮研磨，Trizol法提取大鼠软骨组织总RNA,溶于60μl的DEPC水中, -80℃保存。具体步骤如下：取100mg的大鼠软骨组织，通过液氮研磨，彻底匀浆；转入1.5ml EP管，加入1ml Trizol，颠倒混匀10次，室温静置5min；EP管内加入200μl氯仿(总体积的1/5)充分混匀15s，待乳化后静置15min；4℃12 000r/min离心15min；吸取上层水相至新的1.5ml EP管中，加等体积的异丙醇，充分混匀后，4℃过夜；4℃12 000r/min离心10min，弃上清，加预冷的75%乙醇1ml，4℃12 000r/min离心5min，倒置EP管于滤纸上，尽量除尽上清，室温超净台内干燥5min；加入适量的DEPC水，指弹助溶，取2μl放入小的EP管进行检测浓度及纯度定量，余-80℃保存；以大鼠软骨组织总RNA作为模板， Oligo dT作为引物，用逆转录酶MMLV于42℃逆转录40min；设计大鼠ChM-Ⅰ基因特异性的引物，在两条引物上分别设计了限制性酶切位点(HINDⅢ和NOTI)以便定向克隆。上游引物为：5’GCAGACAAGCTTATGACAGAGAACTCGGACA 3’下游引物为:5’GCAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCCAAGATG 3’；以RT产物为模板，加入上下游引物。用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0试剂盒进行PCR，具体步骤参见试剂盒说明书；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的结果。

1.2.2 大鼠ChM-Ⅰ PCR产物与pcDNA3.1(+)质粒的连接、鉴定。 PCR产物纯化：使用碧云天PCR产物纯化试剂盒，步骤按照试剂盒说明书进行，最终洗脱体积40μl；纯化后PCR产物及pcDNA3.1(+)质粒酶切；酶切产物上样至1% 琼脂糖凝胶，电泳至适当位置后，紫外灯下切胶回收；回收线性化的载体片段；回收后的胶块采用DNA凝胶回收试剂盒(碧云天)，步骤按照试剂盒说明书进行，最终洗脱体积40μl；对回收后的PCR片段及pcDNA3.1(+)质粒定量后，进行DNA连接反应；取10μl连接产物，转化XL1-Blue感受态菌，转化后菌铺至LB-Ampr+平板，37℃温箱孵育过夜；挑取平板上长出的单克隆至LB-Ampr+液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养15h，提取细菌培养物中的质粒。步骤按照小量提取质粒的方法进行(质粒提取纯化试剂盒，碧云天)；进行双酶切，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送天津塞尔生物科技有限公司进行测序。

2 结果

2.1 大鼠ChM-Ⅰ目的基因凝胶电泳结果 将通过大鼠软骨组织获得的ChM-Ⅰ PCR产物，在1%的琼脂糖凝胶进行电泳，分离得到ChM-Ⅰ目的片段 。在1 100bp处可看到较清晰的条带，与设计的引物应得到的产物相符。见图1。

图1 ChM-Ⅰ目的基因凝胶电泳图谱

2.2 阳性克隆的酶切鉴定 挑取的三个阳性克隆，在LB培养基中过夜培养，提取质粒，双酶切质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物，结果显示三个阳性克隆株的细菌提取的质粒均已连接目的基因。见图2。

图2 重组质粒酶切产物凝胶电泳图谱

2.3 阳性克隆的测序鉴定 重组质粒送至天津赛尔生物技术公司进行测序，测序结果显示序列无误，且读码框正确。见图3。

图3 重组质粒中插入片段ChM-Ⅰ的测序结果

3 讨论

肿瘤生长及转移依赖于新生血管的形成，以便为肿瘤的生长提供必要的营养成分，同时也带走肿瘤代谢产物。肿瘤血管形成是一个复杂的动态过程，需要多种微环境的相互作用，其中包括肿瘤周围间质成分和内皮细胞的移位、增殖、重塑及吻合，且受多种因子调节。

研究表明[5]，ChM-Ⅰ的抗血管生成特性可以抑制肿瘤的生长、传播和转移，这表明ChM-Ⅰ功能的丧失可能会诱导肿瘤的发生。ChM-Ⅰ已被证明可以抑制体内人骨肉瘤细胞的生长和增殖，并抑制体外人骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。ChM-Ⅰ可增强体外ES (儿童骨恶性肿瘤)细胞的侵袭性潜力，并可通过调节基质金属蛋白酶9表达来促进体内ES肺转移。此外， ChM-Ⅰ在体外和体内能抑制内皮分化，但在体内肿瘤样本中没有观察到血管发生的差异，这表明ChM-Ⅰ对血管发生的调节似乎并不能增强ES转移[6]。作为ES恶性肿瘤的一种增强剂，ChM-Ⅰ是一个值得进一步研究的主要治疗靶点。临床研究表明，ChM-Ⅰ-异种T细胞受体(TCR)转基因T细胞以骨髓转移为家，并可能导致无移植与宿主病(GvHD)的部分疾病回归，未来仍需要进行临床研究[7]。研究发现ChM-Ⅰ在胃癌中的表达下调，ChM-Ⅰ似乎是一种潜在的肿瘤抑制剂，这也可能成为胃癌治疗和预后的重要生物标志物[8]。ChM-Ⅰ的抗血管生成特性可能会导致对肿瘤进展的抑制作用。ChM-Ⅰ似乎还能够通过调节细胞周期相关基因的表达水平来抑制乳腺癌细胞的生长，因此可能对治疗乳腺癌有潜在的临床应用。ChM-Ⅰ在多种内分泌肿瘤(MEN)中有所表达，在多形性腺瘤的发病机制研究过程中，也检测到ChM-Ⅰ的表达，这表明它有可能参与多形性腺瘤的低血管性和软骨体的形成。在细胞水平上，ChM-Ⅰ似乎能够通过以剂量依赖关系促进细胞增殖和抑制肿瘤细胞的生长来表现出双重作用。低浓度的ChM-Ⅰ似乎可以促进成骨细胞的生长，而高浓度的ChM-Ⅰ抑制了肿瘤细胞的生长和迁移，如人宫颈癌(HeLa)细胞和人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞，并抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖和血管生成[9]。人重组的ChM-Ⅰ(rhChM-Ⅰ) 蛋白可以阻断VEGF-A介导的血管内皮细胞的迁移这一步骤，此步骤是血管形成中的关键的调控步骤。这一作用与细胞伸展的阻滞和在VEGF-A刺激下的肌动蛋白细胞骨架的断裂重组有关。我们可以通过提高肿瘤周围间质中ChM-Ⅰ的浓度，阻断VEGF-A介导的血管内皮细胞的迁移过程，抑制肿瘤血管的生成，进而达到阻止肿瘤细胞生长、转移，最终起到治疗肿瘤的作用。研究表明[10-11]，ChM-Ⅰ可以通过抑制细胞表面相关的内质网伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)-磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号复合物的形成，从而诱导人鼻咽癌(NPC)细胞凋亡。参与ChM-Ⅰ癌症发病机制的细胞和分子信号通路基本未知，仍需要进一步研究。总的来说，这些发现提示ChM-Ⅰ在各种癌症的发病机制中起作用，与ChM-Ⅰ调节软骨细胞分化和抗血管生成特性有关。ChM-Ⅰ在癌症发病机制中的作用需要进一步的研究，以开发其作为癌症治疗的新靶点。

在本实验过程中，大鼠软骨总RNA的提取是影响实验成功与否的重要因素，只有得到质量佳纯度高的软骨总RNA样本，才能更好地扩增目的基因。提取RNA的方法很多[12]，各有优缺点，经过比较并结合本实验的实际需要，笔者采用传统Trizol法来提取大鼠软骨RNA，此种方法实验操作相对简单，实验成本较低，使用更为广泛。通过本次实验，笔者发现在对软骨进行RNA提取时，应该注意以下几点：(1)软骨的取材和保存。在取材过程中，我们应该对所有可能与软骨接触的物件进行去RNA酶处理，以防止RNA的降解，手术器械必须经高温消毒，170℃，6h的高温消毒是可靠的，对所取下的软骨应立即用液氮保存来运输或立即放入-80℃保存。(2)正确的匀浆方法也很重要。本实验表明，为了分离到相对高纯度的RNA，软骨一定要在液氮中研磨成粉， 在加入裂解液后，要进一步细细匀浆，直至2ml的注射器能够完全吸取匀浆液，软骨组织匀浆是否彻底也是保证RNA提取成功的关键步骤之一。(3)防止RNA的降解。RNA不稳定，在环境中很容易降，因此在提取RNA时的操作环境也应保持干洁，尽量保持在超净台中完成实验，同时实验人员需佩戴口罩、帽子等，这样能够最大限度地防止RNA的降解。高纯度、不降解的软骨总RNA样本的获得，为后续实验的成功奠定了基础。

实验中所使用的pcDNA3.1(+)质粒是由pcDNA3发展而来的质粒载体，大小约5.4kb，其具有以下特点[13]：分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数；含有抗新霉素基因，其可以启动neo基因表达3’磷酸转移酶，这种酶能够分解新霉素和G418，从而使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长，获得稳定转染目的基因的细胞株；具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，便于外源基因的插入。除了具有以上的特点外，其还含有人巨细胞病毒启动子，使其在哺乳动物细胞内可以高水平表达。鉴于以上的优点，本实验采用pcDNA3.1(+)来构建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒。笔者设计特异性的ChM-Ⅰ引物时，分别于上下游引物上添加特异性的酶切位点，以利后续的连接与鉴定。为不影响引物与目的基因的特异性结合，在引物上引入酶切位点时，需要在引物的5’端引入。目的基因和质粒进行黏性末端链接，使其具有方向性，因此在引物中引入酶切位点时，要注意方向性，以保证目的基因的正确表达。使用双酶切法消化融合目的基因片段和pcDNA3.1(+)，使目的基因与载体定向连接。在DNA连接过程中，笔者优化了反应条件，适量增加目的基因的比例，大大提高了连接效率。将转化后得到的阳性克隆用双酶切法进行鉴定，酶切后释放出的DNA片段大小与理论值相符，基因测序结果显示序列无误，且读码框正确，证明成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ。转化后得到的阳性克隆除可采用酶切的方法进行鉴定，还可以采用PCR的方法进行鉴定。采用PCR的方法可以使用质粒上的通用引物，也可以使用目的基因的特异性引物，PCR方法简单易行，可以直接使用培养得到的细菌液做模板，无须进行质粒小提，效率更高，但可以产生假阴性，如目的基因中CpG含量较高，可能导致PCR扩增时的失败，从而对结果进行误判，产生假阴性。酶切法准确性更高，但需要先提取质粒，再进行酶切，步骤相对烦琐，结合本实验的需要，笔者选择使用酶切法进行鉴定，以保证更高的准确性。

综上所述，本实验成功构建pcDNA3.1/ChM-Ⅰ表达载体，为后续建立稳定高表达ChM-Ⅰ的细胞株，观察ChM-Ⅰ对肿瘤组织血管形成的抑制作用和其对肿瘤细胞的抑制作用打下基础，为肿瘤的靶向治疗探索新的途径及提供新的药物靶点，进一步提高肿瘤患者的生存期及生活质量。