基于网络药理学和分子对接探讨顾步汤治疗糖尿病足作用机制的研究

唐卫荷，刘 湘，张 玥，赵亚男，王 冠

糖尿病足（diabetic foot，DF）是指因糖尿病所致的下肢远端神经病变和（或）不同程度的血管病变，导致足部溃疡，伴或不伴感染[1]，具有发病率高、致残高、治愈率低的特点，严重影响患者的生活质量。研究显示，每年的截肢患者中有50%为糖尿病患者[2]。因此，DF 的治疗以改善临床症状而减少截肢率为主。

目前，DF 治疗主要包括抗感染、清创治疗等诸多方式[3]。中医药在治疗DF 方面有着丰富的认识和经验。中医学认为DF 属“脱疽”“脚疽”“消渴脱疽”的范畴，《灵枢·痈疽篇》记载“发于足趾，名曰脱痈”，并描述了脱疽肢体变黑、溃烂和坏死等特点。清代陈士铎在《洞天奥旨》中提出：“脱疽之生，止四余之末，气血不能周到也，非虚而何？”其主要病机是气血亏虚、毒邪损脉，为本虚标实之证，故治疗应以补益气血、解毒通脉为治疗大法。顾步汤作为治疗脚疽的经典名方，由牛膝、人参、黄芪、金银花、当归、石斛6 味药组成。诸多研究表明，在其他治疗方式的基础上加以口服顾步汤，能够纠正氧化应激和炎症状态，改善机体内环境及微循环，从而进一步提高治疗的总有效率[4-7]。但对顾步汤的活性成分、作用靶点研究较少，其对DF 的干预机制尚未明确。

网络药理学从生物网络的整体角度来阐释疾病机制和药物作用机制，其研究理念与中医药学的整体论思想相契合，中医药领域也率先提出了“网络靶标”这一网络药理学的核心理论[8]。本研究拟运用网络药理学和分子对接的研究方法，探讨顾步汤治疗DF 的物质基础及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 顾步汤有效成分筛选 检索TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/tcmspsearch.php）获取顾步汤中牛膝、人参、黄芪、金银花、当归的有效成分，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 的条件筛选。通过检索BATMAN-TCM 数据库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm）获取石斛的有效成分。

1.2 成分靶点获取 通过TCMSP 数据库和BATMAN-TCM 数据库挖掘有效成分的作用靶点，并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org）检索出作用靶点的标准名称。

1.3 DF 靶点的获取 在CTD 数据库和TTD 数据库中检索并筛选DF 的相关靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建将有效成分作用靶点与DF 靶点取交集得到关键靶点。通过STRING 数据库（https://www.string-db.org）对蛋白间的相互作用进行预测。

1.5 构建药物-成分-靶点-疾病网络图 使用Cytoscape 3.7.2 软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 运用ClueGO v2.5.5 插件GO Biological Process 与KEGG通路数据库来分析生物过程和通路。

1.7 分子对接验证 对1.5 中构建网络图筛选得到的核心成分与靶点进行分子对接。从RSCB PDB数据库（https://www.rcsb.org）中获得核心靶点蛋白PDB 格式的3D 结构。从TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmspsearch.php）中获取核心成分的mol2 文件。运用AutoDockTools 1.5.6 软件对靶蛋白和小分子配体进行预处理。运用Autodock vina 1.1.2 进行对接及结合能计算，进而分析结合活性。利用Pymol 软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 化学成分筛选 筛选出牛膝有效成分21 个，人参22 个，黄芪20 个，金银花23 个，当归2 个，石斛5 个。除去重复后，最终获得93 个有效成分。

2.2 有效成分作用靶点 获取牛膝有效成分作用靶点121 个，当归65 个，黄芪126 个，人参97 个，金银花126 个，石斛35 个。除去重复值后，最终获得163 个作用靶点。

2.3 DF 相关靶点 最终从两个数据库中筛选获得与DF 相关靶点673 个。

2.4 PPI 网络构建 取交集后，获得关键靶点49个，并绘制维恩图（图1）。在STRING 数据库获取关键靶点的PPI 网络（图2）以及靶点之间的关系。该网络共包含节点49 个，边387 条，平均度值为15.8。

图1 顾步汤有效成分作用靶点与DF 相关靶点交集

图2 顾步汤治疗DF 的关键靶点PPI 网络

2.5 药物-成分-靶点-疾病网络构建 运用Cytoscape 3.7.2 构建药物-成分-靶点-疾病网络（图3）。网络由121 个节点组成，包括6 个中药节点、65 个成分节点、49 个靶点节点和1 个疾病靶点。六边形代表疾病节点，椭圆形代表中药节点，菱形代表成分节点，矩形代表靶点节点。节点度值越大，说明其在网络中的重要性越大。根据度值大小筛选出核心成分和靶点。结果显示，槲皮素、山奈酚以及糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3β）、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/h synthetase 2，PTGS2）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）是该网络的核心节点（表1），表明这些节点是顾步汤治疗DF 的重要成分或靶点。

表1 顾步汤治疗DF 的核心节点

图3 顾步汤治疗DF 的药物-成分-靶点-疾病网络

2.6 药物-成分-靶点-疾病通路分析 通过ClueGO 将顾步汤治疗DF 的生物过程和通路进行分析，运用GO Biological Process 并选择P＜0.01的生物过程，共160 条，关键靶点富集显著的前4条生物过程（见表2）为细胞对化学应激的反应（17个靶点），对脂多糖的反应（16 个靶点），对活性氧的反应（15 个靶点），细胞对氧化应激的反应（14个靶点），证明顾步汤治疗DF 的作用可通过参与多种生物过程达到。

表2 顾步汤治疗DF 关键靶点的生物过程

运用KEGG 进行通路富集分析得到70 条通路。结果表明：晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGE）-糖基化终末产物受体（receptor of AGE，RAGE）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）信号通路是关键靶点显著富集的通路（见图4）。

图4 KEGG 获得的药物-成分-靶点-疾病通路

2.7 分子对接预测 将2 个核心成分[（槲皮素（MOL000098），山奈酚（MOL000422）] 以及3 个核心靶点（PTGS2、GSK3β、NOS2）进行分子对接。对接靶点基因的PDB ID 和结合能等信息见表3，对接结合位点见图5，核心成分与靶点之间可通过氢键连接，图中黄色虚线即是氢键。若结合能＜-7.0 kcal·mol-1，则提示结合活性较好[9]。结果表明核心成分与靶点的结合能均＜-8 kcal·mol-1，顾步汤中核心成分与治疗DF 核心靶点的结合力较好。分子对接结果表明，活性成分槲皮素、山奈酚与核心蛋白GSK3β、PTGS2、NOS2 之间的相互作用力及结合亲和力较强，具有潜在的研究价值。

图5 核心成分与核心靶点分子对接结果图

表3 顾步汤核心成分与靶点的对接结果

3 讨论

顾步汤出自清代陈士铎的《辨证录·卷十三》，是治疗脚疽的经典名方。方中黄芪、人参益气生津、托毒排脓、生肌敛疮，为君药；石斛养阴清热，当归补血活血，共为臣药；金银花清热解毒，为佐药；牛膝引药下行，为使药。共奏大补气血、托毒外出之功效。研究显示，槲皮素、山奈酚为顾步汤治疗DF 的重要有效成分，可通过作用于核心靶点GSK3β、PTGS2、NOS2 和参与TLR 信号通路、IL-17 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、TNF信号通路、VEGF 信号通路等达到治疗DF 的作用，分子对接也验证了以上重要有效成分和核心靶点之间确有结合活性。

3.1 顾步汤的有效成分 槲皮素是一种天然多醇羟基黄酮类化合物[10]，具有降糖、抗炎、抗氧化应激等作用[11-12]。研究发现，其清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的抗氧化能力对人体起保护作用[13]。牛膝和黄芪中的槲皮素能够抑制转录激活因子3 等的磷酸化，抑制ROS 激活，减少氧化应激所诱发的炎性反应[11]。山奈酚是一种多羟基黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等多种作用[14-15]。黄芪、金银花和人参中的山奈酚通过抑制p38 丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路，可发挥抗炎和神经保护作用[16]。这两种有效成分在药物-成分-靶点-疾病网络中作用的靶点多，度值较高，具有降糖、抗炎、抗氧化应激等药理作用，是顾步汤治疗DF 的重要成分。因此推测，在防治DF 方面，顾步汤中牛膝、黄芪、金银花和人参配伍可能会起到一定协同作用。

3.2 作用关键靶点 PPI 网络显示顾步汤中有效成分可能通过核心关键靶点GSK3β、PTGS2、NOS2 起作用。糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase3,GSK3）是一种丝氨酸苏氨酸激酶，能在新陈代谢、细胞周期、糖原合成等方面发挥作用[17]。GSK3 包含两个亚型，其中GSK3β 在肝脏糖代谢中起着重要作用，GSK3β 的磷酸化能够提高糖原合酶活性，从而促进肝脏糖原合成。研究发现，糖尿病患者与非糖尿病患者相比，前者的GSK3β活性是后者的2 倍，活化的GSK3β 促进胰岛素受体底物磷酸化[18]。PTGS2 属前列腺素G/H 合酶，癌细胞中的PTGS2 与前列腺素E2 的产生密切相关，主要参与机体炎症反应，其在调节细胞运动、增殖和抗凋亡等方面具有重要作用[19-20]。NOS2能催化产生NO，NO 和过氧亚硝酸盐的增多会使得细胞结构的氧化损伤[21]。过氧物酶体扩散者激活受体γ 属核受体家族的一员，可以调节多种的信号包括代谢、炎症和氧化应激通路[22-23]。充分证明了顾步汤治疗DF 是多分子、多靶点、多途径相互作用的结果。

3.3 信号通路 KEGG 通路分析表明，顾步汤治疗DF 可能与AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路、VEGF 信号通路、IL-17 信号通路、TLR 信号通路等多条通路密切相关。

AGE-RAGE 信号通路与炎性反应、氧化应激等方面密切相关[24]。研究表明，AGE 与RAGE的特异性结合可诱导氧化应激反应，AGE-RAGE信号通路是影响糖尿病创面氧化应激水平的重要途经[25-26]。糖尿病神经炎症反应与NF-κB 轴活化密切相关，NF-κB 的衍生细胞因子TNF-α 可使环氧合酶-2 过度表达并激活丝裂原活化蛋白激酶，从而进一步触发氧化应激和过度炎症反应[27]。VEGF 是一种以二聚体的形式存在的细胞因子糖蛋白，可促进血管内皮细胞分裂、增殖及迁移，可诱导新生血管形成并增加血管内皮的通透性[28-29]。IL-17 是一种促炎性细胞因子。研究表明，IL-17与胰岛细胞的炎性破坏密切相关，其通过激活NF-κB 信号通路引起TNF-α 等促炎细胞因子释放增加抑制胰岛素信号传导，从而促进胰岛素抵抗[30]。TLR 是指参与非特异性免疫的重要蛋白分子[31]。TLR 信号通路的激活与胰岛素抵抗亦密切相关，糖尿病患者体内TLR2 和TLR4 的表达增多，会促进β 细胞凋亡，抑制胰岛素分泌，导致胰岛素敏感性下降，进而促进糖尿病的发展[32-34]。

综上，本研究通过运用网络药理学和分子对接技术，分析了顾步汤防治DF 的作用机制，网络药理学和分子对接分析结果相互支持，体现了顾步汤在治疗DF 时，具有多成分、多靶标、多个通路协同作用的特点。从中医的角度出发，对清代医家所提出的“虚致脱疽”的病机以及运用顾步汤治疗脱疽进行进一步研究，掘其现代作用机制。网络药理学的应用，以多靶点为研究策略，符合中医药多成分、多靶点的特点，为明确中药复方治疗疾病的作用机制提供了新的研究思路与方法。而未来对于网络药理学的研究还需要进一步规范数据与算法，在紧密联系临床实际的基础上，运用实验研究加以验证。