桃核承气汤含药血清对脂多糖诱导的血管内皮细胞增殖及相关因子表达的影响

郭燕玲，周 鑫，刘 鹏，王 军

下肢动脉硬化闭塞症（lower extremity arteriosclerosis obliterans,LASO）是常见的大血管并发症，由于下肢动脉增厚、变硬，并伴有粥样斑块和钙化，可继发形成血栓，致使动脉管腔狭窄或闭塞进而导致肢体慢性缺血。血管病变的治疗主要是对血管内皮细胞，所以对内皮细胞的研究是防治血管疾病的关键思路之一[1]。目前内皮细胞凋亡逐渐被认同为动脉粥样硬化的始动环节，在病变的易发区血管内皮细胞出现凋亡现象，凋亡的内皮细胞分泌功能紊乱，又会进一步导致正常内皮细胞的凋亡[2]。

桃核承气汤为医圣张仲景所作经方，由桃仁、大黄、桂枝、炙甘草、芒硝组成，具有泻热逐瘀之效，现已广泛应用于血管相关疾病的治疗中。本课题组前期研究发现桃核承气汤可明显改善大鼠的大血管病变情况，减缓纤维化进程[3]。PI3K/Akt 信号通路是人体内基础信号通路之一，与细胞内信号转导有关，在细胞发育、增殖、凋亡等过程中发挥着重要作用[4]。本研究在此基础上，通过不同浓度含药血清干预细胞，筛选最佳浓度，用此浓度含药血清干预主动脉内皮细胞，以PI3K/Akt信号通路作为切入点，观察桃核承气汤含药血清对主动脉内皮细胞的作用及相关因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 SPF 级8周龄雄性SD 大鼠30 只，体质量（200±20）g，购自中国食品药品检定研究院实验动物资源中心，动物合格证号SCXK（京）2017-0005。大鼠主动脉血管内皮细胞株购于北纳生物科技有限公司（编号：BNC337896）。

1.1.2 药物 桃核承气汤（桃仁12 g，大黄12 g，桂枝9 g，炙甘草6 g，芒硝6 g，由天津中医药大学第一附属医院中药房提供），水浸泡30 min，加水煎煮，一煎40 min，取水煎液；二煎加水再煎30 min，取水煎液，合并2 次水煎液，浓缩至850 mL，4 ℃冰箱保存备用。0.9%氯化钠溶液250 mL，国药准字：H37022336，山东辰欣药业股份有限公司。

1.1.3 主要试剂及仪器 DMEM 高糖培养液(货号C11960500BT)；胎牛血清(GIBCO，货号04-102-1A)；脂多糖（LPS）（sigma 公司，货号L2880）；CCK-8 试剂盒(武汉博士德，货号：AR1160)；磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、转化生长因子（TGF）-β 抗体（武汉博士德，货号分别为A00024、A01517-2、BA0290）；假性蛋白激酶3（TRIB3）抗体(南京巴傲得生物科技有限公司，货号BS60451)；GAPDH(南京巴傲得生物科技有限公司，货号AP0063)；辣根过氧化酶（HRP）标记二抗（天津赛尔生物有限公司）。酶标检测仪（上海科华实验系统有限公司，型号：KHB ST-360）；转模仪（上海东玺制冷仪器设备有限公司）；低温冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；转移脱色摇床TS-8（海门其林贝尔仪器制造公司）；流式细胞仪（深圳市达科为生物技术股份有限公司，型号：EXFLOW-204）。

1.2 方法

1.2.1 完全培养基配制 配制高糖培养基（89%DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素），将购买的大鼠主动脉内皮细胞复苏，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养，24 h 后换液。待细胞密度约达80%时进行传代，以1:3 分装到新培养瓶中，2～3 d 后换液，取4～6 代细胞用于后续实验，其余细胞冻存。

1.2.2 含药血清制备 SD 大鼠随机分为桃核承气汤组与空白组，每组15 只。根据动物与人体的每公斤体重计量折算系数表来计算每只大鼠灌胃剂量，每200 g 大鼠的等效剂量约为人的6.3 倍。含药血清组予桃核承气汤灌胃，空白组给予等量生理盐水灌胃，每天给药2 次，连续灌胃7 d，末次给药后1 h 腹主动脉取血，静置30 min，以3 000 r/min 离心10 min，无菌分离大鼠含药血清和大鼠正常血清，分装-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞增殖活性 将主动脉内皮细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于96 孔板中，分6 组，每孔加入100 μL 细胞，余孔填充等量PBS，放入培养箱中培养24 h，分别予以不同浓度（0、10%、15%、25%、30%）含药血清干预，将培养板在培养箱孵育24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续孵育1 h，用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔吸光度。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，按400 μL 培养基与200 μL 细胞悬液将内皮细胞接种于24 孔板，用不同浓度（0、10%、15%、25%、30%）含药血清干预培养过夜后，胰酶消化收集细胞，PBS 冲洗，放入离心管，离心弃上清，加入200 μL Annexin V 结合缓冲液重悬，再次离心弃上清，重复2～3 次，移入离心管，加入5 μL Annexin V，避光孵育10 min，再加入5 μL PI，避光孵育10 min。最后用流式细胞仪测定。

1.2.5 细胞分组及给药 根据CCK-8 法和流式细胞术检测显示10%为最佳药物干预浓度，将主动脉内皮细胞随机分为4 组，分别以不同方式进行干预，分为空白对照组（10%空白血清）、空白血清组（10%含药血清）、模型对照组（1 μg/mL LPS+10% 空白血清）、模型血清组（1 μg/mL LPS+10%含药血清）。

1.2.6 Western-blotting 检测蛋白表达 将主动脉内皮细胞按细胞数3×105个/孔接种于6 孔板中，按上述干预方式分组继续培养24 h。加入裂解液混合物（含增强型RIPA、蛋白酶抑制剂）在冰上裂解30 min，震荡离心，收集各组上清液。BCA法进行蛋白定量，配置SDS-PAGE 凝胶，蛋白上样，将待测蛋白置于电泳装置内，电泳分离后，将蛋白质转移至PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭，置于摇床上封闭2 h，4℃孵育一抗，摇床过夜。洗膜后室温孵育二抗2 h，加入化学显色剂显色后，予凝胶成像系统曝光，以GAPDH为内参用图像分析软件对蛋白条带灰度值进行测定分析。

1.3 统计学分析 数据采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量数据进行正态性检验，以表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度桃核承气汤含药血清对主动脉内皮细胞增殖的影响 CCK-8 检测结果显示，10%含药血清具有更强的促进细胞增殖的作用（图1），证实10%含药血清对细胞生长有一定的促进作用。但随着血清中含药浓度增加其细胞增殖率逐步递减，这可能是高浓度的含药血清对细胞存在一定毒性作用所致。

图1 不同浓度桃核承气汤含药血清对细胞增殖的影响

2.2 不同浓度桃核承气汤含药血清对内皮细胞凋亡的影响 将不同浓度含药血清（0、10%、15%、25%、30%）干预主动脉内皮细胞，随着浓度的增加，细胞凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）逐渐增加（图2）。相较于其他更高浓度的含药血清，10%的含药血清浓度对细胞凋亡的影响最小，且对主动脉内皮细胞的增殖有促进作用，由此佐证含药血清的最佳干预浓度为10 μmol/L。

图2 不同浓度桃核承气汤含药血清对内皮细胞凋亡的影响

2.3 各组PI3K、Akt、TGF-β、TRIB3 蛋白表达水平比较 与空白对照组相比，模型对照组PI3K、Akt、TGF-β 蛋白表达含量均下降，TRIB3 蛋白表达含量升高（P＜0.05）；与空白血清组相比，模型对照组PI3K、Akt、TGF-β 蛋白表达含量均下降，TRIB3 蛋白表达含量升高（P＜0.05）；与模型对照组相比，模型血清组PI3K、Akt、TGF-β 蛋白表达含量均升高，TRIB3 蛋白表达含量下降（P＜0.05），见图3。

图3 各组PI3K、Akt、TGF-β、TRIB3 蛋白表达结果比较

3 讨论

LASO 病变的主要机制是动脉增厚、变硬，并伴有粥样斑块和钙化，其病变与血管内皮细胞状态密切相关。在健康状态下，内皮细胞几乎处于静止，对舒张及收缩血管因子、抗炎及促炎因子等的分泌和平衡具有良性调节作用[5]，一旦内皮失衡，各种细胞因子分泌增多，促血管生成和抗血管生成之间的平衡将被打破，而这也被认为是动脉粥样硬化病变形成和发展的重要阶段，所以对内皮功能增殖和凋亡的研究具有重要的临床价值。

Akt 是PI3K 下游的一种重要激酶，PI3K/Akt信号通路调节着细胞的生长、增殖、迁移、代谢及存活，在细胞凋亡中起着关键作用[6]，现已证实PI3K/Akt 信号通路参与了血管生成[7]，并可诱导血管内皮功能相关因子的表达[8]。TGF-β 能通过上调血管内皮细胞生长因子（VEGF）促进血管新生，同时被TGF-β 刺激后的内皮细胞成血管功能增强，细胞迁移以及增殖能力提高[9]。另有研究表明，PI3K/Akt 信号通路是TGF-β 的下游信号通路，可促进PI3K、Akt 发生磷酸化，参与血管的形成。TRIB3 可改变细胞代谢和凋亡[10-11]，还可与Akt 结合抑制其表达，促进细胞凋亡[12]。Akt 介导的TRIB3 对内皮的调控作用还会刺激血管反应性内膜-中膜增厚和斑块形成[13]，增加动脉粥样硬化的风险。

LPS 是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，经LPS诱导可导致组织细胞损伤，引起血管内皮细胞凋亡，也是目前常见的内皮细胞损伤模型构建方式[14]。现代药理学研究认为，桃核承气汤具有多成分、多靶点调节的特点。用STRING 数据库对桃核承气汤分析后显示蛋白相互作用的核心基因之一为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1/Akt），其激活后起到调节细胞增殖、分化、凋亡等作用[15]。同时桃核承气汤参与的抗炎、抗细胞凋亡、促进细胞存活等机制，可以有效防治糖尿病、动脉粥样硬化等疾病。

本实验结果显示，LPS 诱导内皮细胞损伤后，诱使细胞凋亡的TRIB3 蛋白表达上升，促进血管内皮生成的TGF-β、PI3K、Akt 表达下降，而经桃核承气汤含药血清干预后蛋白表达趋势相反。笔者认为桃核承气汤含药血清对损伤的内皮细胞有促进新生作用，可以影响与内皮细胞生成相关的表达因子，如TRIB3、TGF-β、PI3K 和Akt。

本研究还观察到内皮损伤后TRIB3 表达含量增加，而TRIB3 的高表达可抑制Akt 的磷酸化，经桃核承气汤含药血清培养后，TRIB3 表达的下调有助于PI3K/Akt 信号通路的激活。同时TGF-β作为PI3K/Akt 信号通路的的上游信号，含药血清干预后，TGF-β 表达的上升也刺激了PI3K/Akt信号通路的激活，更加佐证了桃核承气汤含药血清可促进内皮细胞生成。

综上，桃核承气汤含药血清可减轻主动脉内皮细胞的凋亡，促进内皮细胞的新生，其作用机制可能是激活PI3K/Akt 信号通路，而其激活途径可能与TRIB3、TGF-β 有关。