海兰褐蛋鸡产气荚膜梭菌的分离鉴定

任伟欣，王潘龙，秦一峰，栾庆东，游仪雪，徐茜，郭泉宇，乔磊，尹燕博，张晓轩

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.青岛农业大学动物医学院；3.吉林农业大学动物科技学院）

我国养禽业在世界水平上属于发展较快较好的国家，一直以来我国的禽产品产量与家禽存栏量均领先于大多数国家[1]。自20世纪70年代以来我国的养禽业已有了悠久的历史，但以前的规模很小，养殖水平也较低，与发达国家差距较大。改革开放后由于养禽规模的改变致使我国养禽业迅速发展，特别是蛋鸡产业更是迈向了一个新的台阶[2]。在2009年，我国的鸡蛋产量就已经超过了世界总产量的40%，位居世界第一，蛋鸡存栏量更是达到了16亿只。在畜牧业中蛋鸡养殖属于发展较快的行业，鸡蛋又是我国人民的重要食品。发展蛋鸡产业不仅能增加养殖户的收入，还能改善人们的饮食，提高人们的生活水平[3]。因此蛋鸡养殖业对于我国非常重要，提高蛋鸡的生产效率以及鸡蛋的品质更是我们应该高度重视的问题。

在蛋鸡的养殖过程中常常会发生多种疾病，例如坏死性肠炎，也称肠毒血症，是由于感染了A型或C型产气荚膜梭菌而引起的一种肠道坏死、出血的多因素急性传染病[4]，4周龄以上的蛋鸡通常易感[5]。主要临床症状为采食量下降、产蛋量减少、背羽粗乱、翅膀下垂、抑郁烦躁、排红褐色干燥粪便，严重时鸡只消瘦、眼窝凹陷、站立困难、排黑色稀便，伴有恶臭味，有时还混有血液[6]。该病发病突然死亡快并容易出现复发状况，属于散发性家禽细菌性疾病[7]。在世界大部分地区均有报道，严重危害了家禽养殖业的发展并给全球养禽业造成了巨大的经济损失[8]。

产气荚膜梭菌作为坏死性肠炎的主要病原菌，又称产气荚膜梭菌，是由美国Velchii等[9]从一具尸体中分离出的一种厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，属于人畜共患的条件性致病菌。该菌以低水平广泛存在于多种健康动物的肠道菌群中，同时也存在于土壤、粪便和污水等自然界中[10-11]。当环境和饲养条件改变，机体受到应激时会导致该菌不断增殖而引起动物的坏死性肠炎、人类的食物中毒和创伤性气性坏疽等[12-14]。目前产气荚膜梭菌被发现可产生α、β，ε，ι，θ，κ，λ等20种毒素，而α、β、ε和ι作为其主要的致病毒素将产气荚膜梭菌分为了5种毒素类型，分别为A、B、C、D、E型[15-16]。

由于产气荚膜梭菌等病原菌对蛋鸡的影响较大，因此16SrRNA测序技术作为当代最热门的快速鉴定病原菌的方法被广泛使用[17-18]。起初，人们都是用纯培养和传统分析方法对微生物进行研究，后来人们发现只有0.1%～1%的微生物能够通过纯培养的方式被发现，大量具有巨大应用潜能的微生物由于不可培养均无法被研究。为了解决这一问题，组学概念应运而生，16SrRNA测序就是其中一种。由于其打破了传统微生物研究方法所存在的局限，因此组学概念一出现，就被广大学者们所接受[19-20]。虽然组学的研究方法还存在一些缺陷，但这并不能阻止广大学者们应用其去研究环境中各类微生物的热情。组学的指导思想十分清晰，它以反向生物学为中心，围绕特定的生态环境，利用独有的程序和方法，对所研究的基因组序列进行分析，对功能基因进行注释，同时通过对16SrRNA可变区的测定可以对环境中存在的多种微生物进行同时分类和准确定量[21-22]。而且近年来，组学的分析程序也不断被改善，数据库不断被扩充，更有研究人员在生物信息学方面研发了许多可实用的软件，这使得16SrRNA测序技术不管是在测序深度和准确度，还是在性价比等方面都要强于传统分析方法[23]。

试验应用组学技术及多重PCR等方法对产气荚膜梭菌进行分离鉴定，研究其生物学特性和基因分型，探讨坏死性肠炎的诱发机制，可为今后蛋鸡坏死性肠炎的诊治和预防提供理论依据，为产气荚膜梭菌的鉴定提供素材，对蛋鸡养殖业的发展具有促进作用。

1 材料

1.1 病料

从山东省青岛市即墨区某蛋鸡场患病蛋鸡体内无菌采集小肠、盲肠和直肠内容物。

1.2 主要试剂

PCR反应试剂，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；细菌微量生化反应管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；羊血、革兰氏染色试剂盒，购自北京索莱宝生物科技有限公司；含铁牛奶培养基、厌氧培养基、胰蛋白胨—亚硫酸铁—环丝氨酸琼脂基础培养基（TSC）、血琼脂基础培养基（BAB）、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂基础培养基（SPS），购自青岛海博生物科技有限公司。

1.3 产气荚膜梭菌分型鉴定引物

根据产气荚膜梭菌主要致病毒素（α、β、ε、ι）的基因序列来设计多重PCR分型鉴定引物并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列见表1。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Primers sequence of multiple PCR

1.4 试验动物

20只350日龄的患病海兰褐蛋鸡。

2 方法

2.1 样品的采集

从山东省某规模化蛋鸡场采集20只患有坏死性肠炎的病死鸡，将其带回试验室，全身消毒后剖开腹腔，分别取出患病鸡小肠、盲肠和直肠这三个肠段，并在肠段两端结扎后放于无菌培养皿中，在厌氧培养箱中将20只鸡的三个肠段内容物分别混合均匀后再两两混合，形成10份样品。

2.2 细菌的分离培养及染色镜检

将合成后的样品用厌氧液体培养基在厌氧培养箱中进行50万倍梯度稀释，分别涂布于TSC、BAB、SPS这三种固体培养基上，在37℃厌氧条件下恒温培养24 h，取疑似菌落用三线法在相应的培养基上进行二代纯化培养，并将纯化后的单个菌落接种于厌氧液体培养基中。待液体培养基浑浊后，取少量涂片镜检。

2.3 生化鉴定及牛乳发酵

将镜检疑似产气荚膜梭菌的菌株从二代培养基上挑取单个菌落接种于麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、明胶、甘露醇、硝酸盐等生化鉴定管及灭菌后的含铁牛奶液体培养基中，37℃厌氧培养24 h，观察其反应。

2.4 16Sr RNA测序鉴定

将镜检和生化鉴定后判定为产气荚膜梭菌的菌液进行12 000 r·min-1，3 min离心，收集沉淀，加入dd水在涡旋振荡器上混合均匀后用煮沸的开水煮6 min，再进行16SrRNA基因扩增和琼脂糖凝胶电泳，扩增体系为25μLEx-Taq酶，上下游引物各1μL，模板1μL，最后加入灭菌水22μL，总体系为50μL。将跑有条带的PCR样品送测序。

2.5 毒素分型鉴定

将产气荚膜梭菌进行多重PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，观察其条带数及条带大小以鉴定其毒素分型情况。多重PCR的总反应体系为25μL，分别为Ex-Taq酶12.5μL，模板2μL，上下游引物各1μL，灭菌水8.5μL。反应条件为：94℃欲变性5 min；94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃再延伸10 min。

2.6 菌种保存

准备好冻存管，在管壁上做好标记。在厌氧培养箱中吸出分离菌的菌液与灭菌后的甘油以3∶1的形式混合均匀后冻于-80℃保存。

3 结果与分析

3.1 细菌的分离培养及染色镜检结果

将蛋鸡肠道内容物涂板后发现其活菌数为1×108CFU·g-1。如图1所示产气荚膜梭菌在BAB琼脂平板上为表面光滑、边缘整齐、圆形、半透明菌落，在SPS和TSC固体培养基上则是以黑色为中心的灰白色圆形菌落。将其染色后1 000×镜检可发现大量革兰阳性，两端钝圆，大多单个存在的粗短杆状细菌（图2）。

图1 产气荚膜梭菌的分离培养结果Fig.1 Isolation and culture results of C.perfringens

图2 产气荚膜梭菌的染色结果Fig.2 Coloration result of C.perfringens

3.2 生化鉴定及牛乳发酵结果

将产气荚膜梭菌接种于生化鉴定管中，可发现其对麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖均有发酵作用，产酸产气，不发酵鼠李糖、纤维二糖、木糖、棉子糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇，液化明胶，不产生吲哚，无尿素酶，不还原硝酸盐。将菌株接种于灭菌后的含铁牛奶液体培养基中，37℃培养24 h后出现“爆裂发酵”现象（图3）。

图3 产气荚膜梭菌的生化鉴定及牛乳发酵结果Fig.3 Biochemical identification and milk fermentation results of C.perfringens

3.3 16Sr RNA测序鉴定结果

将分离菌株进行16SrRNA基因扩增及1%的琼脂糖凝胶电泳，发现扩增后的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中均显现出约1 500 bp的条带，符合16SrRNA条带长度，可以送测序。将测序回来的结果在NCBI上进行基因序列比对，发现7株分离菌与产气荚膜梭菌的同源性高达99.86%～100%，图4为7株菌16S rRNA扩增结果图。为了更直观的显示7株菌（H1-H7）与产气荚膜梭菌的亲源关系，试验在NCBI上搜索了产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、破伤风梭菌（Clostridium tetani）、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）、巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum），以及嗜热丝孢菌（Lutispora thermophila）的16SrRNA基因序列，将嗜热丝孢菌作为外群利用MEGA6软件根据最大似然法建立了系统进化树（图5）。在进化树中可以看到试验的7株分离菌与产气荚膜梭菌的同源性最高，因此确定该试验中分离菌H1～H7均为产气荚膜梭菌。

图4 16Sr RNA扩增结果Fig.4 16SrRNA amplification results

图5 系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree

3.4 毒素分型鉴定结果

将产气荚膜梭菌进行多重PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳后，发现7株产气荚膜梭菌均仅跑出一条约325 bp的目的条带（图6），符合α毒素的条带长度，因此确定试验分离出的7株产气荚膜梭菌均为A型。

图6 毒素分型结果Fig.6 Results of toxin typing

4 讨论

该试验中患病鸡群精神沉郁，食欲减退，鸡只消瘦，羽毛松乱，同时伴有腹泻，便血和脱水等症状。刨检时发现小肠膨胀，肠壁脆弱，浆膜上有栗状坏死斑。十二指肠、盲肠和直肠肠壁有出血点，粘膜溃疡，肠道内容物为混有血液的褐色或黑色稀粪。发病鸡用土霉素、痢特灵等药物无效果，而饲喂喹乙醇，肌注庆大霉素和青霉素后病情有所好转。因此将该病诊断为坏死性肠炎，并由于产气荚膜梭菌对喹乙醇等药物敏感判定该病可能是由产气荚膜梭菌引起。

产气荚膜梭菌作为鸡肠道中的常驻菌群之一，在正常情况下不表现明显临床症状。当鸡群抵抗力下降、饲料转换不良时会引起鸡坏死性肠炎。该病一般在肉鸡中多见，特别是2～6周龄的肉鸡，很少发生于蛋鸡[24]。该病的发病特征分为亚临床和临床两种类型。亚临床型坏死性肠炎临床症状明显，病死率较低；临床型则无任何先兆迹象，病鸡突然死亡[25]。该病的形成多有明显的诱因，包括破坏肠道上皮表面，诱导粘液产生；影响肠道菌群组成；改变家禽免疫状态等。例如全麦饲粮会改变肠道黏度，产生复杂的碳水化合物，从而导致产气荚膜梭菌的增殖；病毒感染可导致肠道表面的物理损伤，诱导禽类的免疫状态下降；饮食中添加鱼粉会改变肠道微生物群，促进产气荚膜梭菌的增长，对胃肠道上皮细胞造成严重损害[26-27]。总而言之，诱发因素可导致产气荚膜梭菌的快速感染，迅速增殖，随之发病。

产气荚膜梭菌可在不同动物中引起多种疾病，例如家畜的“猝死症”、禽类的坏死性肠炎以及人类的食物中毒等，这些不同的发病形式主要取决于病原体所产生的主要毒素类型[28]。产气荚膜梭菌可根据这些主要毒素的不同组合分为A、B、C、D、E5种类型。A型菌的主要毒素为α毒素，同时α毒素也存在于B、C、D、E这四种类型菌中，β毒素作为B型菌的致死毒素和C型菌的坏死因子则同时存在于B型和C型菌中。ε作为D型菌的主要致病因子同时存在于B型和D型菌中，而ι毒素和α毒素则同时存在于E型菌中[29]。A型疾病已在鸡和羊中得到证实，而B型疾病主要发生在羊身上，可由于β毒素导致坏死性肠炎，偶尔也会由于ε毒素而导致神经系统改变。C型疾病主要发生在大多数物种的新生儿中，由于β毒素对胰蛋白酶的作用非常敏感，而初乳对蛋白酶具有抑制作用，这可能是导致这种年龄倾向的重要原因。D型疾病主要发生在绵羊和山羊身上，该病的特点是产生神经学方面的临床症状。E型疾病传统上被认为是兔子的疾病，但偶尔也会在羊和牛的身上被检测出来[30]。鸡的坏死性肠炎多由A型或C型产气荚膜梭菌引起，根据试验的多重PCR扩增结果显示，从病死蛋鸡肠道内容物中分离出产气荚膜梭菌均仅检测出α毒素，因此判定该试验的分离菌均为A型，说明引起该蛋鸡场发生坏死性肠炎的产气荚膜梭菌大多为A型产气荚膜梭菌。

鸡坏死性肠炎在全球大多数国家均有报道。根据研究显示，已有超过50%的鸡群感染坏死性肠炎。其中亚洲发病率最高，其次是欧洲及拉丁美洲等[29]。在我国主要集中于长江以北地区，例如山东、河北、山西等[9]。散养鸡场较集约化鸡场更易发病[31]，并且在同一鸡群或者同一地区可反复发生，持续出现病死鸡和淘汰鸡[32]，给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。对该试验中患病鸡群进行解刨时发现患病鸡。

在以前，抗生素的使用可对坏死性肠炎起到一定的抑制作用。但随着蛋鸡养殖规模的扩大，抗生素的使用也越来越广泛，导致抗生素的耐药性逐渐增加。近年来已报道产气荚膜梭菌对庆大霉素，链霉素，草酸，林可霉素，红霉素和螺旋霉素等均具有耐药性。不仅如此，抗生素在肉、蛋等食品中还出现了残留问题，导致消费者对无抗产品的需求增加，因此抗生素的使用要求越来越严格，蛋鸡的患病率也就越来越高[33]。据估计，坏死性肠炎每年给全球家禽养殖业造成的生产损失超过20亿美元。这已经引起了全球各大养禽业的高度重视，各个国家也已经开始了对鸡坏死性肠炎以及产气荚膜梭菌的研究，力争尽快控制该疾病[28]。试验对患病鸡场进行的研究也可为预防鸡坏死性肠炎提供理论依据及基础素材，进一步推动蛋鸡养殖业的发展。

由于该类疾病在出现临床症状后死亡的速度较快，因此免疫预防成为了最重要的控制措施。这要求在平时的饲养过程中应及时清粪，保持环境卫生良好，勤消毒，加强通风及饲粮管理[34]。在日常饲料中添加一些营养物质，增强机体免疫力[35]。同时对病死鸡进行无害化处理，减少传染的可能性，抵制该病的大规模发生[24]。由于地方或国家使用抗生素的政策不同，产气荚膜梭菌的抗生素耐药模式也不相同。因此，在对家禽进行疾病治疗时应考虑其耐药性，以确保快速治疗。同时也应及时寻找抗生素替代品，以避免产气荚膜梭菌产生新的耐药性[33]。

5 结论

根据16SrRNA基因测序结果显示，实验从20只患病蛋鸡体内共分离出7株产气荚膜梭菌，同源性均在99.86%～100%之间。将产气荚膜梭菌分离株进行多重PCR鉴定后显示均为A型。因此，认为引起该鸡场发生大规模坏死性肠炎的可能是A型产气荚膜梭菌。