外源褪黑素对干旱胁迫下大豆氮代谢及产量的影响

曹亮，张玉先，金喜军

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319）

大豆是我国重要的油料作物之一，富含大量的蛋白质、油脂以及丰富的次生代谢产物，被人类广泛用于食品加工、生物饲料等方面。氮代谢是作物体内最基础的生理过程之一，其在作物生长发育期间的变化直接影响植株矿质营养的吸收及蛋白质的合成[1]。氮代谢能够否正常运转与作物产量呈正相关，作物氮代谢机制主要通过NR、GS、GOGAT等关键酶进行催化调节[2]。干旱胁迫会导致土壤耕层水分长期亏缺，可供给作物吸收的有效水分大量减少，作物无法吸收到足够维持其正常生长发育的水分，致使其正常的生理活动受到干扰，进而导致作物体内蛋白质降解，氨基酸含量发生改变，硝酸还原酶活性降低，氮代谢过程受到干扰，作物养分吸收受阻，致使作物根系生长受到抑制。氮代谢关键酶活性降低会阻碍作物吸收氮素，同时还会对同化产物的形成和转运产生不利影响，导致产量降低[3]。

褪黑素（Melatonin）又名N-乙酰基-5-甲氧基色胺，属吲哚类激素，作为近年来新兴的植物生长调节剂一直被用于植物逆境调节等方面，同时它还广泛地存在于植物体中[4-5]。上世纪，已被证实褪黑素是一类激素物质，参与动物的生长发育和信号转导，后有学者从藻类中分离并鉴定出了褪黑素，证明了植物体中也存在该物质，随着科研人员的进一步研究发现，褪黑素可以调节植物的生长发育，并缓解逆境胁迫对植物造成的损伤。研究发现，褪黑素可有效增加侧根和不定根的再次生长，同时它还可以提高植物的抗逆性，增强氮代谢进程[6]。研究表明，外源褪黑素可提升NaHCO3胁迫下下黄瓜幼苗叶片的氮代谢水平，有助于黄瓜幼苗有效抵抗逆境胁迫[7]。低温条件下褪黑素显著增强甜瓜氮代谢酶的活性，稳定叶片因逆境胁迫造成铵态氮增加的现象，进而提高植物对逆境条件下的适应性[8]。

大豆是固氮作物，对氮代谢有较高的要求，而外源褪黑素对干旱条件下大豆各器官氮代谢相关的研究鲜有报道。因此，研究以大豆品种“绥农26”为供试品种，探讨干旱条件下外源褪黑素对大豆氮代谢的调控效应以及对产量损失缓解程度，为未来逆境下使用化控手段提高大豆抗逆性提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

实验于2018—2019年在大庆市国家杂粮工程技术研究中心试验基地进行，供试大豆品种为绥农26，盆栽用桶直径30.0 cm，高33.0 cm，所有盆栽均放置在遮雨棚中。大豆种子采用75%的酒精处理后，用无菌水洗净后播种。每盆播种6粒，VC期定苗，保留长势一致的3株幼苗。采用称重法控制土壤含水量为田间持水量的80%。鼓粒始期记为第1 d，正常供水处理仍保持土壤含水量为田间持水量的80%，干旱处理通过停止供水逐步使土壤含水量达到田间持水量的50%，并维持此含水量至处理结束，凋萎含水量为田间持水量的40%。每个处理30盆，具体处理设置如下：

正常处理（CK），维持盆栽中土壤含水量为田间持水量的80%；

干旱处理（D），停止供水，并每天称重，于第10天达到田间持水量的50%，而后补水以保持当前含水量，至第28天恢复至田间持水量的80%，直至收获；

干旱喷施褪黑素处理（D+M），在干旱处理的基础上，在第11、12、13天夜晚21点喷施浓度为10 0μmol·L-1褪黑素。

取样时间为鼓粒初期后的第18、23、28天取样（褪黑素处理后5、10、15 d），其中硝酸还原酶活性取样后立即进行测定，其他酶活性等生理指标的样品用液氮冷冻并快速转移至-80℃冰箱保存待分析用，用于干物质积累测定的样品经105℃杀青后在80℃下烘干至恒重，称量干重后粉碎待分析用。

1.2 氮代谢生理指标的测定

硝酸还原酶（NR）测定参照徐龙光[9]方法测定。谷氨酰胺合成酶（Gs）参照王小纯等[10]方法测定。谷氨酸合成酶（GOGAT）参照陈继康等[11]方法测定。谷氨酸脱氢酶（GDH）参照现代植物生理学实验指南测定[12]。铵态氮含量根据Oliveira H C等[13]方法测定。硝态氮根据Reguera等[14]方法测定。酰脲含量参照刘承宪等[15]方法测定。

氮素积累量=干物质积累量×氮素含量

1.3 产量的测定

待植株成长至成熟期时，选取长势相同且具备代表性的15株测产，盆栽试验以单株粒重表示产量。

1.4 数据分析

使用SPSS进行数据分析，用Excel绘制图表。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对干旱胁迫下大豆氮代谢关键酶活性的影响

由表1所示，谷氨酸脱氢酶在干旱后第5、10、15天整体呈先上升后下降的趋势。与CK处理相比D处理谷氨酸脱氢酶活性显著下降，降幅为30.22%、20.44%和26.05%。同时D+M处理相较D处理显著提升了12.78%、8.95%和14.68%。而谷氨酸合成酶与硝酸还原酶活性则伴随着干旱时间的延长整体呈现下降趋势，D处理的谷氨酸合成酶与硝酸还原酶活性在第10天相较于第5天降低了14.20%、10.67%，第15天相较于第10天降低了17.85%、24.56%。而D+M处理则相对降幅有所减少，其谷氨酸合成酶与硝酸还原酶活性在第10天相较于第5天降低了7.66%和8.65%，第15天相较于第10天降低了15.16%和19.62%。而谷氨酰胺合成酶在D+M处理相较于D处理中提高了10.66%、12.73%和18.69%。

2.2 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆铵态氮含量的影响

由图1所可知，与CK处理相比，D处理叶片与根系中的铵态氮含量显著升高，分别在第5、10、15天提升了13.35%、40.40%、27.45%和10.18%、26.60%、45.17%。D+M处理相较于CK处理在叶片铵态氮含量提高了10.98%、16.27%和27.44%，而在茎秆中D处理的铵态氮含量也显著高于CK，但D+M处理相较于D处理则有效降低了8.16%、8.53%和19.90%。

图1 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆铵态氮含量的影响Fig.1 Effects of exogenous melatonin on ammonium nitrogen in Soybean under drought stress

2.3 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆硝态氮含量的影响

由图2所可知，根、茎、叶中的硝态氮含量在第5、10、15天这三个时间段中呈现下降趋势，其中茎秆中硝态氮含量下降幅度最大，D处理在第10天相较于第5天茎秆中硝态氮含量下降了19.31%，而叶片与根系中D处理的硝态氮含量只下降了2.26%和14.09%。与CK处理相比D处理中叶片的硝态氮含量在第5、10、15天提升了19.73%、33.76%、38.32%，茎秆中提升了12.90%、33.11%、24.48%，根系中提升了22.08%、29.09%、41.64%。与D处理相比，D+M处理在第5、10、15天根、茎、叶硝态氮含量减少了12.40%、19.64%、13.95%，9.08%、11.90%、20.69%和11.19%、16.42%、19.09%。

图2 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆硝态氮含量的影响Fig.2 Effects of exogenous melatonin on nitrate nitrogen in Soybean under drought stress

2.4 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆酰脲含量的影响

由图3所可知，与CK处理相比D处理叶片中酰脲的含量在第5、10、15天下降了38.99%、46.81%和49.40%，茎秆中酰脲的含量下降了27.55%、20.84%和26.99%，根系中酰脲的含量下降了25.75%、19.20%和34.02%，均达到显著水平。而D+M处理相较于D处理酰脲含量显著上升，且叶片和茎秆在第15天叶片酰脲含量上升幅度达到最高25.90%和22.87%，根系酰脲含量在第10天上升幅度达到最高13.97%，均达到显著水平。

图3 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆酰脲含量的影响Fig.3 Effects of exogenous melatonin on the urea of soybean organs under drought stress

2.5 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆氮素积累的影响

由图4可知，与CK处理相比，D处理后第5天植株氮素积累量呈现出上升的趋势，叶片、茎秆、根系的氮素积累量上升幅度为10.71%、10.22%和2.07%，D+M处理相较于CK处理提高了11.78%、11.00%和11.08%。随着干旱时间的延长，D处理中氮素积累量逐渐下降，与CK处理相比，D处理后10、15 d叶片、茎秆与根系中的氮素积累量下降了19.28%、32.32%，29.46%、85.49%和47.59%、63.08%，均达到显著水平。与CK处理相比，D+M处理后10、15 d下降了7.66%、17.56%，14.59%、33.50%和16.97%、33.53%。

图4 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆氮素积累的影响Fig.4 Effects of exogenous melatonin on nitrogen accumulation in Soybean under drought stress

2.6 外源褪黑素对干旱胁迫下大豆产量的影响

由表2可知，2018年与CK处理，D处理产量显著下降，其中单株荚数降低了7.04%、单株粒数降低了8.07%、百粒重以及单株粒重分别降低了28.75%和27.70%。施用褪黑素可有效缓解干旱对大豆产量相关指标的抑制，最终提高产量。与D处理相比，D+M处理上述指标依次提高2.02%、5.77%、12.91%和10.86%。综合2018年和2019年各项产量指标来看，外源褪黑素可降低干旱胁迫对大豆各项产量指标的抑制，最终提高干旱条件下大豆的产量。

表2 外源褪黑素对干旱胁迫下产量构成的影响Table 2 Effects of exogenous melatonin on yield components under drought stress

3 讨论

氮是影响作物生产力的重要标志[16]，氮代谢过程中，植物将外界环境的无机氮通过氮代谢关键酶经过一系列调节与催化成为可供植物吸收利用的有机氮[17]，这些氮代谢关键酶活性可整体反映出胁迫下氮素转化的过程[18]。研究发现，较长时间的干旱会严重降低硝酸还原酶活性[19]。曹让等[20]发现干旱会使棉花叶片的氮代谢功能紊乱，引起蛋白质的大量降解，氨基酸含量改变，硝酸还原酶活性受到抑制。另有研究表明[21]，干旱胁迫下，当氮代谢关键酶中的硝酸还原酶受到抑制时，会降低大豆体内GS和GOGAT活性，进而导致大豆体内的铵积累过多，产生毒害效应。研究发现，大豆当遭遇干旱胁迫时氮代谢关键酶呈现下降趋势，而褪黑素的施用有效缓解干旱胁迫对氮代谢关键酶的抑制，并增强其活性。这可能是因为干旱会造成大豆体内水解酶活性增强，蛋白质合成减少，进而造成NR活性降低[22]，而NR活性的高低会间接影响氮素的转化效率，这使得NO3-还原、NH4+同化受阻，导致NH4+及中间产物酮戊二酸的供应不足[23]，从而降低了GS和GOGAT的活性，由此推测这可能是底物不足引起的连锁反应。褪黑素的施用加速了NR还原NO3-生成NH4+的进程，同时保障了GS/GOGAT循环和GDH途径的正常运行。

作物生长过程中氮素的存在必不可少，氮素在氨基酸、蛋白质和其他含氮化合物的合成中极为重要，根系吸收固定的氮素主要以铵态氮与硝态氮为主，铵态氮可直接吸收利用，其余氮素则以硝态氮为主要形态的方式被吸收入植物体内。植物体内氮含量可作为直接反应氮代谢是否活跃的重要指标，是作为衡量大豆体内的氮素营养、氮素同化利用与再利用状况的重要指标。有研究表明，铵态氮含量可作为评判植株是否遭遇胁迫的重要指标[24]，而硝态氮含量的变化代表着作物体内氮代谢水平与氮的同化利用情况[25]。有研究表明干旱胁迫会诱导植株体内硝态氮、铵态氮含量显著增加[26]，这与研究结果相同，干旱胁迫导致大豆根、茎、叶中的铵态氮和硝态氮含量显著增加，而施用外源褪黑素后可大豆植株中的硝态氮与铵态氮含量显著降低，这种现象可能干旱导致无机氮含量上升，代谢受阻，还原同化能力下降，且褪黑素改善了这一情况。但与李丽杰等[27]研究结果有所差异，这可能是栽培条件差异造成了干旱胁迫对作物对无机氮吸收能力不同。

酰脲是大豆氮素储备与运输的主要形式，其含量的多少与大豆固氮酶的活性息息相关[28]。研究中，干旱条件下植株根、茎、叶中的酰脲含量显著下降，同时随着干旱时间的延长，酰脲的整体含量也在逐步降低，这说明干旱抑制了氮素在植物体内的运移，同时氮在植物体内的积累减少，而施加外源褪黑素可促进大豆各器官中酰脲含量的上升，这与董雪[29]的研究结果相同。植物的氮素积累量决定着最终产量的高低[30]。研究发现，干旱胁迫下根、茎、叶中的氮素积累量呈现先上升后下降的趋势，产量显著下降，外源褪黑素减轻了干旱胁迫带来的不利影响，显著提高了干旱胁迫下大豆根茎叶中的氮素积累量，产量显著上升，这与李昊阳[31]研究的结果相同。可见外源褪黑素可促进植株在干旱胁迫下维持根瘤共生固氮的正常运作，并有助于在逆境下根瘤固氮酶活性的提高，从而稳定氮素的积累，提高氮素利用率，进而提高产量，研究结果与李菁华等研究一致[32]。

4 结论

干旱会导致氮代谢关键酶活性下降，无机氮含量增加，氮素积累和转运受到阻碍，产量降低。外源褪黑素可显著提高干旱胁迫下氮代谢关键酶活性，降低无机氮含量，增加酰脲含量，提高植株各部位的氮素积累量，保障植株在干旱胁迫下的氮素同化和转运，最终提高产量。