中性盐和碱性盐胁迫对芸豆可溶性糖及钾钠离子含量的影响

刘本帅，于立河，2，于崧，2，杨贺麟，闫天雨，朱雪天

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2.黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室）

土地盐碱化作为重大的全球性非生物环境胁迫因素，严重破坏了土地资源，制约着当今农业的发展，目前全世界盐渍化土地面积约为10亿hm2[1]。世界三大盐碱土分布区的松嫩平原成为了我国最大的苏打盐碱土分布区[2]，仅我国东北地区的松嫩平原盐碱化土地面积就高达373.3万hm2[3]。由于对大农业和生态保护的观念的缺乏，土地盐碱化面积和盐碱化程度逐年增加，碱胁迫会降低土壤渗透势、使离子失衡、打乱生理过程、抑制植物生长、降低作物的质量和产量。严重地区甚至会导致植物死亡，土壤盐碱化成为限制作物产量的重要原因[4-5]。因此盐碱地的改良和综合开发利用已成为农业生产急需解决的难题[6]。因此，如何加强对盐碱地农业高效利用，提升我国耕地的农业生产能力水平，进而对增加耕地数量，促进国家粮食安全的保障等具有重要意义[7-8]。

芸豆作为人类主要的食用豆类和松嫩平原重要的经济作物，减轻盐碱胁迫对芸豆生长的抑制，对满足人们日益增长的粮食需求，促进盐碱地区，尤其是松嫩平原农业和经济的可持续发展具有重要意义。目前对于芸豆的研究多为病害防治方面，关于盐碱地对芸豆产量的影响也鲜有报道[9]，除此之外对芸豆的膜脂氧化程度的影响、可溶性糖和离子含量以及膜脂过氧化程度测定的分析未见报道。研究发现，在盐碱胁迫下，大豆Na+/K+含量随胁迫强度增加而上升，盐碱胁迫下稻米中的K+、Na+、Mg2+、Ca2+含量比非盐碱胁迫下有显著提高，但具有明显的品种间差异[10-11]。在盐碱胁迫条件下，随着胁迫时间增加，大豆叶片和根系的丙二醛浓度呈上升趋势[12]。李姝睿[13]研究表明：叶中的可溶性糖含量在受到50 mmol·L-1和100 mmol·L-1浓度NaCl胁迫时，随盐浓度增长而呈上升趋势，而在175 mmol·L-1时出现下降趋势。刘建新[14]研究发现：盐碱混合胁迫下裸燕麦幼苗叶片游离氨基酸、脯氨酸和可溶性蛋白质含量显著提高，可溶性糖含量显著降低。研究以耐盐碱型芸豆品种HYD为试验材料，用NaCl和NaHCO3溶液设置了不同浓度梯度来模拟不同程度的盐碱胁迫，模拟中性盐和碱性盐环境对芸豆进行不同时间段的盐碱胁迫，以探讨不同浓度的盐碱胁迫对芸豆幼苗叶片的脂质过氧化程度、可溶性糖和离子含量的影响，为进一步探究芸豆抗盐碱机制、选育耐盐碱芸豆品种提供理论依据，并为解决东北地区芸豆盐碱胁迫问题提供思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种为试验室前期从42份芸豆品种中筛选出的耐盐碱性较强的芸豆品种“HYD”[15]，该品种为黑龙江省农业科学院提供。

1.2 试验设计

种子处理：选取大小一致、籽粒饱满的自然风干芸豆种子，置于30%H2O2中表面消毒10 min，然后将消毒完的种子用无菌水漂洗5～6次，25℃浸种12 h。

培养条件：试验于黑龙江八一农垦大学农学院智能人工气候生长室内进行，采用Hoagland营养液水培芸豆幼苗至第一片复叶完全展开后加入Na-Cl和NaHCO3溶液胁迫的方法，来模拟盐碱对芸豆幼苗的胁迫。将处理好的种子摆入装有蛭石的育苗盘中，在人工气候生长室内培养，设定光照强度为300μmol·m-2·s-1，光照周期（14/10）h（昼/夜），温度（25/23）℃（昼/夜），和相对湿度50%～60%，并且每天用1/2Hoagland营养液（pH5.7）将其浇透。待种子萌发出现一对真叶时，选取整齐度一致的幼苗移栽到带有圆孔的泡沫板上，在1/2 Hoagland营养液中通气培养，然后用正常的Hoagland营养液继续培养，之后每隔2 d换1次培养液。培养期间要注意使用电动气泵进行24 h的持续通气，以避免根系无氧呼吸，保证幼苗的良好生长。于芸豆幼苗第一片复叶完全展开后进行盐碱胁迫处理。

胁迫条件：试验设置0，50，100，150 mmol·L-1四个浓度梯度（其中浓度“0”作为对照处理），分别用NaCl和NaHCO3正常Hoagland营养液模拟盐碱胁迫。用pH计测定胁迫液的pH值，NaCl胁迫组pH为5.7，6.57，6.66，6.79；NaHCO3胁 迫 组 的pH分 别 为5.7，8.26，8.49和8.73。

取样部位：第一片完全展开的三出复叶。

取样时间点：胁迫后0，24，96 h。

1.3 试验方法

1.3.1 MDA含量的测定

MDA含量的测定参照《植物生理学试验手册》[16]。称取0.5 g待测芸豆幼苗叶片，加入5 mL 10%的三氯乙酸（TCA）在研钵中低温研磨至匀浆状态，放入离心机中，3 000 g下离心10 min。然后取上清液2 mL，并在其中加入2 mL硫代巴比妥酸（TBA），混和均匀后于沸水浴中加热15 min，迅速冷却后再次离心，取上清液分别在450，532，600 nm下比色测定吸光值。根据以下公式计算MDA浓度后进一步算出芸豆叶片中MDA含量：

1.3.2 可溶性糖含量测定

称取0.5 g剪碎的样品放入试管中，加入20 mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min，冷却后过滤，将滤液无损的转入100 mL容量瓶中，定容至刻度摇匀。从中取1.0 mL于试管中，加入蒽酮试剂5 mL，轻摇混匀后再次进行沸水浴时间10 min，冷却后测定620 nm吸光值。用葡萄糖做标准曲线。

1.3.3 离子浓度的测定

将烘干至恒重的待测样品进行粉样并过筛（0.25 mm），从中准确称取0.3 g放入消煮管中（注意尽量避免样品粘附在管壁上），然后加入5 mL浓硫酸，摇匀后置于电炉上加热。首先使用小火加热，浓硫酸逐渐分解，待冒出大量白烟后再逐渐提高温度。消煮管在溶液呈均匀的棕黑色时去下，等待片刻，将30%的H2O2在稍冷后滴加10滴（边滴加边不断摇匀），再次置于电炉上加热至微沸，消煮约5 min。然后再次将消煮管取下，重复上一步骤，稍冷后逐滴加入H2O2并继续加热。如此反复进行数次，注意H2O2的用量逐渐减少，直到消化液变成无色透明清亮的液体时停止滴加H2O2。继续加热5 min，以去除消煮管内残余的H2O2。将消煮管内液体转移至100 mL容量瓶中，并将消煮管反复用蒸馏水冲洗，冲洗体均无损地转入容量瓶中，冷却至室温然后定容。最后以该溶液用原子吸收法测定芸豆幼苗叶片中的Na+、K+含量。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫对芸豆幼苗脂质氧化程度的影响

如图1所示，芸豆幼苗叶片MDA含量随着NaHCO3和NaCl胁迫的增加呈上升趋势，相同处理时间两种盐胁迫差异显著（P＜0.05），尤其高于50 mmol·L-1的处理浓度时，上限和下限更加明显。当溶液为150 mmol·L-1胁迫浓度条件时，与对照组相比，处理后24 h的MDA含量在NaCl和NaHCO3胁迫下分别增加59.47%和75.46%，处理后96 h分别增加70.80%和103.81%，两种盐溶液处理之间达到显著水平（P＜0.05）。表明碱性盐胁迫较中性盐对芸豆幼苗的膜脂造成氧化损伤的程度更大。

2.2 盐碱胁迫对可溶性糖含量的影响

由图2可以看出，芸豆幼苗叶片中的可溶性糖含量随着胁迫浓度的增加呈现先增加后降低的趋势，且在处理（P<0.05）中达到显着水平，在50 mmol·L-1较低浓度溶液处理时，可溶性糖含量显着高于对照。NaHCO3胁迫下可溶性糖含量的变化范围较NaCl胁迫高，随着浓度的增加，增加量也会随着增加但增长缓慢，可溶性糖含量在处理浓度为100 mmol·L-1时达到最大值。在胁迫后24 h的NaCl和NaHCO3胁迫相比对照分别升高了119.15%和207.19%；胁迫后96 h分别升高131.36%和142.74%。在150 mmol·L-1的胁迫浓度时，可溶性糖含量逐渐减少。从整体上分析可以看出，随着处理浓度的递增及胁迫时间的延长，可溶性糖含量变化表现为实验组显著高于对照组，且NaHCO3溶液胁迫下的变化范围较NaCl溶液胁迫大。

图2 两种盐胁迫对芸豆幼苗可溶性糖含量的影响Fig.2 Effects of two kinds of salt stress on soluble sugar content of common bean seedlings

2.3 盐碱胁迫对Na+含量的影响

芸豆幼苗叶片中的Na+的浓度随着NaCl和NaHCO3胁迫强度的增加呈现逐渐升高的变化趋势，150 mmol·L-1盐溶液处理浓度时达到最高值，各处理之间（P＜0.05）差异达到显著水平。NaCl和NaHCO3胁迫的Na+含量最大值在处理后24 h分别比对照高225.90%和289.04%；处理后96 h分别比对照高出201.60%和348.29%。在NaHCO3胁迫作用下观察到的Na+累积量较NaCl胁迫更高，说明NaHCO3胁迫对芸豆生长的不利影响更大。

2.4 盐碱胁迫对K+含量的影响

由图4可知，芸豆幼苗叶片中的K+含量随着Na－Cl和NaHCO3两种盐溶液胁迫浓度的增加而逐渐下降，即使在较低浓度（50 mmol·L-1）胁迫下也达到显著水平（P＜0.05），在150 mmol·L-1的最低浓度下，与对照相比，胁迫后24 h NaCl和NaHCO3胁迫下芸豆幼苗叶片中的K+最低含量分别减少19.58%和43.33%；胁迫后96 h分别降低31.30%和47.22%。在100 mmol·L-1处理浓度时，K+含量降低的表现得最明显。在同一时间点，各浓度处理均表现为NaHCO3胁迫下芸豆幼苗叶片中的K+低于NaCl胁迫。

图3 两种盐胁迫对芸豆幼苗Na+含量的影响Fig.3 Effects of two kinds of salt stress on Na+content of common bean seedlings

图4 两种盐胁迫对芸豆幼苗K+含量的影响Fig.4 Effects of two kinds of salt stress on K+content of common bean seedlings

2.5 盐碱胁迫对K+/Na+的影响

由图5可知，随着处理浓度的增加两种盐胁迫下芸豆幼苗叶片中的K+/Na+显著降低（P＜0.05）。在胁迫后24 h，150 mmol·L-1NaCl和NaHCO3胁迫下处理组相比对照组分别下降75.32%和85.43%；胁迫后96 h分别下降77.22%和88.23%。在相同浓度下，碳酸氢钠处理的K+/Na+处理少于NaCl。NaHCO3处理的KK+/Na+降低较多。

图5 两种盐胁迫对芸豆幼苗K+/Na+的影响Fig.5 Effects of two kinds of salt stress on K+/Na+content of common bean seedlings

3 讨论

植物生活在盐逆境中，最先接触到盐分并受到伤害的是细胞质膜[17]，盐胁迫会导致植物细胞膜脂过氧化和细胞膜间透性增大，因此会对植物细胞质膜造成伤害。细胞内大量的电解质和一些小的有机分子会渗出。膜脂过氧化产物对植物防御系统的破坏再次加剧膜脂过氧化[18-19]，破坏了细胞内物质交换平衡，由于细胞脂膜的特殊性，所以在研究可溶性糖和离子含量的同时也对细胞脂膜这一指标进行了测定。研究中，芸豆幼苗叶片MDA含量随着NaCl和NaHCO3两种盐溶液胁迫的加重呈增加趋势，且相同处理时间两种盐胁迫之间差异显著，尤其是当处理浓度高于50 mmol·L-1时，上升变化更为明显，随着处理时间的递增MDA含量也逐渐递增，处理时间为96 h时达到最大值，表明碱性盐胁迫较中性盐对芸豆幼苗的膜脂造成氧化损伤的程度更大。

可溶性糖是植物生长和基因表达的重要调节剂。在植物的生命周期中起着重要的作用，并且也具有信号功能。在调节植物生长的同时，它可以与植物激素等其他信号形成复杂的信号网络系统，还可以为植物生长和发育提供能量和代谢中间体，随着盐碱浓度的增大，植物可溶性糖含量呈先增多后减少的趋势[20]，耐盐性强的在较高盐碱浓度下可溶性糖含量仍显著增加。检测植物体内的可溶性糖含量可以体现植物的生长发育情况。试验中采用加入蒽酮试剂后再进行沸水浴的方法测定620 nm处的吸光值绘制了可溶性糖含量的曲线，随着胁迫浓度的增加，芸豆幼苗叶片中可溶性糖含量呈现出先上升后下降的趋势，并在各处理间达到显着水平。在50 mmol·L-1较低浓度时，可溶性糖含量缓慢增加，且增加幅度随着浓度的增加而增大。可溶性糖含量在100 mmol·L-1时达到最大值，胁迫处理24 h的可溶性糖含量显著上升，且胁迫处理96 h后，可溶性糖含量仍持续增加。当150 mmol·L-1盐胁迫时，可溶性糖含量逐渐减少。从整体上分析可以看出，随着两种盐溶液处理浓度的递增和胁迫时间的延长，可溶性糖含量显著升高，两种盐胁迫下NaHCO3的变化程度较NaCl大。

盐胁迫严重影响着种子萌发和幼苗生长过程，芸豆萌发期和幼苗期对盐分的响应反映了其适应逆境的生态机制[21]。一般情况下，盐胁迫下非盐生植物的生长会受到抑制，盐生植物则在一定浓度的盐环境下可以正常生长，并且只有当外界盐浓度超过其生长最适盐度时才会减缓其生长[22-24]，尤其是在缺Na+时其生活史不能完成[25]。所以Na+对植物生长具有刺激作用，导致Na+对植物生长刺激作用的主要因素是细胞伸展效应和植物水分的平衡效应。芸豆幼苗叶片中的Na+的浓度随着NaCl和NaHCO3胁迫强度的增加呈现逐渐升高的变化趋势，在150 mmol·L-1盐浓度时达到最高，且两种盐处理间差异均达到显著水平。

在植物的生长发育过程中不仅Na+对生物体的生理功能具有影响，K+对生物体的生理功能有一定的影响。K+是植物细胞中含量最丰富的阳离子之一，可促进植物细胞内酶的活性，且K+是平衡电荷的主要阳离子，不同浓度的K+在细胞内外分布可形成细胞跨膜电势，促进阴离子的长距离运输，对生物体的生理功能具有一定的影响。芸豆幼苗叶片中K+含量随着NaCl和NaHCO3两种盐溶液胁迫浓度的增加而逐渐下降，在50 mmol·L-1较低浓度胁迫下达到显著水平（P＜0.05），且在浓度为150 mmol·L-1时K+含量达到最低，在同一时间点，各浓度处理均表现为NaHCO3胁迫下芸豆幼苗叶片中的K+低于NaCl胁迫。试验结果表明随着处理浓度的增加两种盐胁迫下芸豆幼苗叶片中的K+/Na+显著降低。在胁迫后24 h，150 mmol·L-1NaCl和NaHCO3胁迫下处理组相比对照组下降明显，胁迫后96 h分别下降情况相同。在相同浓度下，NaHCO3处理的K+/Na+较NaCl处理更低。NaHCO3处理的K+/Na+降低更快。

4 结论

试验在不同浓度的NaCl和NaHCO3胁迫下进行，研究了芸豆在不同时间和不同胁迫浓度下的膜脂氧化伤害程度、可溶性糖含量和离子含量。结果表明，膜脂造成氧化损伤的程度随着两种盐溶液处理浓度的递增和胁迫时间的延长而增大，碱性盐胁迫较中性盐对芸豆幼苗的膜脂造成氧化损伤的程度更大。随着两种盐溶液处理浓度的递增和胁迫时间的延长，与对照相比，可溶性糖含量显著增加，在NaHCO3胁迫作用下观察到芸豆幼苗叶片中的Na+累积量较NaCl胁迫更高，NaHCO3胁迫下芸豆幼苗叶片中的K+低于NaCl胁迫，两种盐胁迫下芸豆幼苗叶片中的K+/Na+变化相同，随着胁迫浓度的增加而显着降低。