单一和复合菌剂发酵豆腐渣的营养价值评定

刘爱瑜，宋艳磊，赵寿培，车大璐，赵俐辰，李晓宇，李伯森，郝云武，高玉红*，张会文*

（1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001；2.承德市兽药管理站，河北 承德 067000；3.宽城县农业农村局畜牧工作站，河北 承德 067000）

豆腐渣是以豆类为原料加工豆制品所产生的副产品，含有丰富的营养成分，是宝贵的蛋白质饲料资源，我国每年生产约280 万t［1］。因豆腐渣具产量大且营养丰富的优点，作为动物蛋白饲料具有较高的开发价值。干豆腐渣替代羔羊精料中的胡麻饼和豆皮可提高其日增重和屠宰率，且降低了饲料成本［2］。但豆腐渣含抗营养因子（胰蛋白酶抑制素、皂素等），且难贮存，容易氧化酸败，导致目前其利用率不高，仅5%~15%，造成饲料资源的浪费［1］。如何开发再利用豆腐渣成为当下的研究热门。

目前我国正面临饲料原料尤其是蛋白质原料紧缺的难题，豆腐渣作为蛋白饲料资源的开发和利用在某种程度上可以缓解饲料供应不足的现状。微生物发酵工艺可以提升豆腐渣的营养价值，降解抗营养因子。已报道的关于豆腐渣发酵研究均采用酵母菌、乳酸菌、光合菌和放线菌等复合菌进行发酵，发酵的产品饲喂猪［3］、牛［4］和羊［5］等家畜后显著提高了其生产性能。酵母菌和乳酸菌是食品发酵工艺中常用的菌类。酵母菌能使豆腐渣中部分醛类物质转化为醇、酸、酯等物质，赋予豆渣特殊的香气［6-7］，而乳酸菌具较强的代谢碳水化合物产酸能力，可提升豆腐渣纤维的品质［8-9］。芽孢杆菌作为饲料发酵的另一种重要微生物，因其繁殖速度快，抗逆性比较强，且能够分泌较为丰富的酶系，常被应用于豆粕、玉米秸秆和小麦麸皮等的发酵工艺中［10-12］，但芽孢杆菌用于豆腐渣发酵的研究很少。本研究选用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和植物乳酸杆菌3 种来源广泛、成本低且发酵效果好的菌剂，通过单一和两两复合、三种复合的发酵方式研究豆腐渣发酵的效果，筛选适宜的发酵菌剂及复合类型，为畜牧生产中豆腐渣的发酵提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料

新鲜豆腐渣来源于河北省保定市豆腐加工厂，实测含水量94.10%。

1.1.2 发酵菌株

试验采用的发酵菌株为河北农业大学微生物实验室保藏的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，Bs）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，Lp）和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae，Sc）。

1.1.3 培养基

酵母菌的培养基选择YEPD 固体培养基和YEPD 肉汤培养基；植物乳酸杆菌的培养基为MRS 固体培养基和MRS 肉汤培养基；枯草芽孢杆菌的培养基为LB 固体培养基和LB 液体培养基。上述培养基均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.4 发酵菌的扩增培养

根据培养基配方将培养基溶解并灭菌，然后进行发酵菌的扩增培养，操作步骤如下：

（1）制备MRS、YPD 和LB 固体斜面培养基；

（2）将保藏的Bs、Lp 和Sc 菌种转移到斜面固体培养基，30 ℃培养2 d；

（3）制备MRS、YPD 和LB 液体培养基；

（4）从斜面固体培养基挑取一环菌落转移至5 mL 液体培养基中，30 ℃培养1 d；

菌液变浑浊后，将液体培养基内的菌液转移至200 mL 三角瓶中进行扩增，适温下震荡培养1 d。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验共设8 组，7 组为加菌发酵组，其菌剂添加量为鲜豆腐渣重量的1%，各组菌剂添加量如表1所示，1 组为对照组，不添加任何菌剂组。豆腐渣发酵采用10 号（240 mm×340 mm）封口袋，排尽空气后密封，于恒温培养箱中30℃发酵5 d，每隔24 h 采集一次样品进行测定。每组均设3 个重复，每个重复15 袋，每次采样取3 袋，每袋30 g 新鲜豆腐渣。

表1 试验分组及发酵菌剂添加量Table 1 The grouping of experiments and supplemental levels offermentation microbial

1.2.2 豆腐渣的发酵

豆腐渣发酵的操作过程如下：

（1）取新鲜豆腐渣于65 ℃烘箱中烘干至含水量60%，然后依试验设计分组；

（2）接种复壮后的Sc、Lp 和Bs（菌悬液浓度均约106CFU•mL-1），进行单一、两两复配及三者复配发酵（复合菌种配比为1∶1 和1∶1∶1），接种量为鲜豆腐渣重量的1%；

（3）加菌发酵组按菌剂∶红糖＝1∶1 的比例加入红糖，均匀混合；

（4）将豆腐渣装入密封袋，30 ℃恒温培养箱密封发酵5 d；

（5）每隔24 h 取豆腐渣样品，4 ℃冷藏待测常规营养成分。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 发酵豆腐渣的物理评价

采用感官评价法对8 组发酵豆腐渣的颜色、气味和滋味等物理指标进行评价［13］。评价小组由10位（5 位男生和5 位女生）评价员组成，从非常好（8~10 分）、好（6~8 分）、较好（4~6 分）、一般（2~4分）、差（2 分以下）5 个等级进行评分，各指标评分标准及权重见表2。

表2 发酵豆腐渣感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standard of fermented tofu residue

1.3.2 发酵豆腐渣营养成分测定

测定发酵豆腐渣样品养分含量。干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、钙（Ca）、磷（P）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量参照《饲料分析及饲料质量检测技术》［14］中的方法进行测定。DM 含量测定采用烘干恒重法；CP 含量测定应用半自动凯氏定氮仪（Kjeltec 8400，FOSS，丹麦）采用凯氏定氮法；EE含量测定采用索氏提取法；Ca 含量测定采用高锰酸钾法；P 含量测定采用钼黄分光光度法；参照Van Soest 法［15］借 助 半 自 动 纤 维 仪（ANK-OM A2000i，ANKOM，美国）测定NDF 和ADF 含量。

1.4 统计分析

采用SPSS 20.0 软件对不同发酵时间豆腐渣的营养成分数据进行重复测量多因素方差分析，对豆腐渣发酵前后养分含量数据采用单因素方差分析，差异显著采用Duncan 氏法进行多重比较，以P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著，数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 豆腐渣发酵后的物理特性

豆腐渣发酵前和发酵5 d 的颜色变化如图1 所示。随着发酵时间的延长，豆腐渣的颜色逐渐加深，由正常的乳白色逐渐变为棕黄色，发酵第5 天豆腐渣颜色最深，加菌的试验组豆腐渣颜色均较对照组深。另外，从发酵第2 天开始，豆腐渣逐渐散发酸香味，随着发酵时间的延长，发酵香味越来越浓。发酵豆腐渣感官评价结果如表3 所示。两两复合和三者复合的发酵菌组豆腐渣颜色、气味和滋味评分均显著高于单一菌组和对照组（P<0.01）。评 价 总 分 排 序 为：G 组>F 组>D 组>E 组>C 组>B 组>A 组>对 照 组，三 种 菌 复 合 组（G 组）总分均显著高于其它组（P<0.01），对照组总分显著低于其它组（P<0.01），单一菌发酵以C组效果好，显著优于A 组（P<0.01），两两复合发酵以F 组效果最好，显著优于E 组（P<0.05）。

表3 发酵豆腐渣感官评价Table 3 Sensory evaluation of fermented tofu residue 分

图1 豆腐渣发酵前和发酵后的颜色变化Fig.1 Color change of tofu residue before fermentation and 5 days after fermentation

2.2 不同发酵时间豆腐渣营养成分的变化

不同菌发酵对豆腐渣各种营养含量的影响结果如图2 所示。由图2A、D、H 可见，随着发酵时间的延长，各组CP、P 和DM 的含量均呈上升趋势，以复合菌发酵效果最为显著，E、F 和G 组CP 含量显著高于其它组（P<0.01），而E 和G 组的P 含量显著高于其它组（P<0.05），且表现为发酵2 d 后呈显著性增加趋势（P<0.05），尤其3 种菌发酵的G 组效果最好；从图2B、C 可以看出，各组EE 和Ca的含量均呈上升趋势，其含量最高分别可达5.62%和0.82%。其中，E、F、G 组的EE 和Ca 含量显著高于其它组（P<0.05），且发酵2 d 和5 d 的EE 含量显著增加（P<0.05），发酵3 d 的Ca 含量显著增加（P<0.05）；由图2E、F 可知，随着发酵时间的延长，各组ADF 和NDF 的含量呈下降趋势，E、F、G 组 发 酵2~5 d 的NDF 和 发 酵3~5 d 的ADF 含量呈显著降低趋势（P<0.05）；从图2G 可以看出，不同菌剂对发酵豆腐渣Ash 含量的影响较小，各组间Ash 含量未表现出显著性差异（P>0.05）。

图2 豆腐渣发酵过程中营养成分的变化规律Fig.2 Nutrient change during tofu residue fermentation

豆腐渣发酵前后营养成分的比较如表4 所示。与发酵前（未发酵）新鲜豆腐渣相比，通过5 d 发酵，3 种菌单一或复合发酵的豆腐渣中DM、CP、EE、Ca 和P 含量均显著提高（P<0.01），3 种菌复合发酵组（G 组）相比其他组发酵效果好，较发酵前分 别 提 高8.04%（DM）、1.85%（CP）、4.92%（EE）、0.49%（Ca）和0.38%（P）（P<0.05），而NDF 和ADF 含量均显著降低（P<0.01），较发酵前分别降低16.43%和5.79%，Ash 含量发酵前后无显著差异（P>0.05）。不加菌的对照组发酵前和发酵后相比，DM、CP、EE、Ca 和P 含量均显著提高（P<0.01），较发酵前分别提高5.28%、0.41%、2.24%和0.21%，NDF 和ADF 含量均显著降低（P<0.01），较发酵前分别降低7.25%和3.09%，对照组Ash 含量发酵前后无显著差异（P>0.05）。

表4 豆腐渣发酵前后营养成分比较Table 4 Nutrients Comparison of tofu residue before and after fermentation

3 讨论

复合菌的发酵效果优于单一菌，很可能因为发酵豆腐渣是经过复合菌混合厌氧发酵，其中的酵母菌和芽孢杆菌等好氧菌的存在为乳酸菌的生长繁殖创造了厌氧环境［16］，研究发现，酵母菌在发酵过程中产生酒香味或苹果芳香味，增加豆腐渣风味，且豆腐渣颜色随发酵时间的增长不断加深，酚类物质是产生样品黄色色调的主要来源，豆腐渣经菌剂发酵后会产生酚类物质，因此黄色不断加深［17-18］。

豆腐渣由于抗营养因子的存在，营养成分的利用率并没有达到理想效果，而微生物发酵作为一种新型的饲料处理方式，有利于豆腐渣CP、EE、Ca 和P 等养分的有效利用率提高。本实验中随着发酵时间的延长，不管单一菌还是复合菌发酵，豆腐渣的营养成分均发生了变化，豆腐渣发酵过程中，由于微生物的生长繁殖需要一定的营养物质，菌与原材料接触时间越长，作用时间越久，菌自身增殖越多，相互作用产生代谢产物越多，从而造成豆腐渣成分发生持续的改变［19］。本实验结果还表明，经发酵的豆腐渣中DM、CP、EE、Ca 和P 等含量均显著提高，发酵5 d 后CP 含量显著提高，由14.15%增至16.00%，提高了1.85%，可能的原因是由于发酵过程中微生物将豆腐渣中的CP 转化为家畜更易利用的菌体蛋白，同时也消耗了碳水化合物，最终导致发酵CP 含量的升高，另外，发酵后豆腐渣的DM、Ca 和P 含量可表现出增加趋势，也可能与糖和脂类等有机物在发酵过程中消耗而引起矿物质累积有关。微生物在生长代谢过程中消耗能量，使能量物质减少，而豆腐渣中Ca 和P 在DM 中的比例则相对提高［20-21］，且发酵过程中Ca和P 元素借助菌剂发酵固化于饲料原料中，因此其含量增加［22］，而豆腐渣中纤维含量降低可能是因为菌剂反应中产生的纤维素酶以豆腐渣中的纤维为原料进行降解，菌体在生长繁殖过程中会产生

多种代谢产物，产生了将纤维和碳水化合物降解为单糖的纤维素酶，因而脂肪含量下降。本实验结果表明，豆腐渣CP 含量在发酵2 d 后显著增加，ADF 和NDF 分别在第2 d 和第3 d 显著下降，罗文等［23］研究认为，当发酵时间为48 h 时，豆腐渣和苹果渣混合饲料CP 的含量增加，ADF 和NDF 含量降低，这与本研究结果一致，说明随着发酵时间的增加，微生物能够利用基质中不溶性纤维素进行繁殖和代谢，蛋白质含量逐渐增加。

不同菌剂发酵原理及发酵效果存在一定的差异。豆腐渣中添加枯草芽孢杆菌进行发酵时，一些代谢产物如高活性的蛋白酶和纤维素酶将会产生，将豆腐渣中的CP、NDF、ADF 等大分子养分酶解成还原糖、功能性小肽和氨基酸，而且微生物会在发酵过程中利用糖类物质合成菌体蛋白，且其分解产物的重新组合和微生物菌体的自溶作用可以产生新的营养成分和生物活性物质，提高饲料的营养价值［24］。乳酸菌作为一种革兰氏阳性菌，在有氧和无氧条件下均能生长繁殖，常被用作饲料工业中的发酵菌剂。利用乳酸菌发酵饲料时，除具有降解大分子营养物质的功能，还能降低pH，使有害微生物的生长受到抑制，利于饲料中养分的保存［25］。王宁等［26］研究认为，豆腐渣在发酵前期可以快速形成酸性环境，有效抑制霉菌、梭菌和腐败菌等有害微生物的繁殖，可抑制CP 的降解，减少CP 损失，这与本研究结果一致。也有研究认为［27］，乳酸菌发酵饲料还可以产生多肽、有机酸、维生素、氨基酸、功能性活性肽以及未知生长因子等营养物质，以提升饲料的营养价值。另外，本研究中采用的另外一种发酵菌—酿酒酵母菌也是食品和饲料加工中比较受欢迎的发酵菌剂，采用该菌对饲料进行发酵时，可将糖类分解为酒精和二氧化碳，产生酒香味，刺激动物采食欲望，还可通过自身繁殖来增加饲料原料中的营养物质含量，进而提升饲料营养价值［18］。也有研究指出［28-29］，发酵饲料过程中酵母菌可以吸收饲料表面氧气，促进厌氧真菌生长繁殖，增加纤维降解菌的数量，提高饲料中NDF 和ADF 的降解率，这与本研究中豆腐渣发酵后NDF 和ADF 含量显著下降相吻合。虽然单菌发酵在某种程度上可以改善饲料的营养价值，但多菌复合发酵可以发挥不同菌的各自优势，弥补单菌发酵的不足，甚至可能会有一定的加和效应，进而更好地提升饲料品质。本研究中3 种菌来源广泛，成本较低，且发酵过程简单，可操作性强，便于畜牧场/养殖户的现场操作，具有一定的实用性，且随着2020 年国家启动的“饲料端禁抗、养殖端减抗限抗”政策，畜禽的健康水平已经受到诸多关注，发酵豆腐渣可能会由于其含益生菌、酶及其他生物活性物质从而改善畜禽消化道环境，提升畜禽的健康水平，这将是我们下一步要开展的研究。

4 结论

新鲜豆腐渣添加1% Bs、Lp 和Sc 进行单一或复合发酵明显改善了其感官指标，表现为颜色变黄、气味酸香；发酵显著提高了豆腐渣的CP、EE、Ca 和P 等 养 分 含 量，降 低 了NDF 和ADF 含 量，且复合菌较单一菌发酵效果好，尤其Bs+Lp+Sc 三菌联合发酵豆腐渣效果最佳。