山西省糜子DNA 分子身份证的构建

薛亚鹏，李元阳，陈凌，王海岗，王瑞云，*，乔治军*

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031）

糜子（Panicum miliaceumL.）是禾本科黍属草本植物，又称为稷、黍和糜黍［1］。糜子籽粒没有黏性，糜穗长且细，长粒，可制作炒米，而黍籽粒有黏性，黍穗为条状，圆形粒，叶片细长且尖，可用于酿酒［2］。糜子起源于中国［3］，主要种植在年降水量低于400 mm 的北方贫瘠旱地农业区［4］，我国主要的糜子的生态栽培区有7 个，分别为黄土高原春夏糜子栽培区、南方秋冬糜子栽培区、北方春糜子栽培区、青藏高原春糜子栽培区、华北夏糜子栽培区、西北春夏糜子栽培区和东北春糜子栽培区［5］，黄土高原地区水分蒸发强、干旱缺水且气温较低，适宜糜子生长［6-7］。由于地区和气候等诸多因素影响，异源四倍体糜子不同资源的DNA 信息繁杂［8］，不同种质DNA 基因片段的差异有助于其种质的准确识别。

2003 年加拿大动物学家首次提出DNA 条形码，将特定专有的条形码及其代表的特定数字信息关联种质资源，直观呈现种质基因组信息，形成在特定领域发挥关键作用的信息库［9］。SSR 标记技术具有分布广泛、操作简单、多态性丰富等特点［10］。基于DNA 片段上的遗传密码差异，采用SSR 标记技术，可以构建该种质特定的DNA 身份证。李清等［11］通过6 对SSR 引物，对大豆种质的多态性DNA 片段进行排序，构建了广东省96 份大豆种质的DNA 身份证；武志江等［12］使用20 对核心引物，创建了145 份火龙果种质的DNA 身份证；孙枭等［13］利用14 对SSR 引物对山楂资源进行扩增，构建了48 份山楂种质资源的DNA 身份证。

糜子种质资源方面的研究较多。Hu 等［14］和王瑞云等［15］研究发现黄土高原糜子栽培区基因组的遗传多样性丰富，黄土高原可能是糜子起源地［16］。连帅等［17］通过5 个特异性SSR 标记，对5 个不同生态区的糜子种质资源进行了遗传多样性分析，表明糜子资源的多态性具有很强的地域性。虽然糜子基因组与遗传多样性的研究较多，但基于SSR标记的分子身份证相关研究很少。为探索糜子起源地，保护山西省糜子的种质资源，加强对品种的认定和辨别，本试验采用14 对高基元SSR 引物，对来自山西省糜子栽培区的20 份糜子种质进行糜子DNA 分子身份证的构建，为准确鉴定山西省的糜子种质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取山西省地区的20 份糜子种质作为试验材料，详情见表1。

表1 试验用20 份糜子材料明细表Table 1 The detail of 20 broomcorn millet accessions used in the experiment

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取

室内穴盘种植至三叶期，用CTAB 改良法［18］提取目标DNA，然后检验DNA 的完整性和DNA浓度［15］。

1.2.2 SSR 引物筛选、PCR 扩增和检测

随机选取代表性糜子材料6 份（表2），利用王瑞云等［15］构建的五、六碱基引物共14 对进行筛选，选择条带图像清晰、多态性好的引物用于DNA 分子身份证的构建。

表2 6 份代表性糜子材料明细表Table 2 List of 6 representative broomcorn millet materials selected in the experiment

PCR 扩增体系为2×MasterMix10 μL（共20 μL）、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL（上下游引物的终浓度都0.4 μmoL·L-1）、蒸馏水7.4 μL 左右、试 验 所 提 取 出 的DNA 模 板1 μL（30~80 ng·μL-1）。PCR 仪器程序设定数值为：预热，94 ℃4 min；变性，94 ℃40 s，退火，72 ℃40 s；反应总时长为8 min。

利用银染检测技术，检测DNA 所对应的酸性蛋白，检测PCR 产物。

1.3 数据处理

根据所获得电泳凝胶的扩增条带的位置，在Excel 表中记录整理基因型数据（若同一位置存在扩增条带记录数据为1，同一位置不存在扩增条带记录数据为0），并将数据转换成为不同格式，以适应不同的软件计算实验参数。用PowerMarker 3.25［19］和PopGen 1.32［20］软件，计算SSR 遗传多样性参数；用ID Analysis 4.0 软件创建字符串DNA分子身份证，再应用条形码生成器（http：//barcode.tec-it.com/zh）和在线二维码生成软件（https：//cli.im/）生产成条形码和二维码DNA身份证。

2 结果与分析

2.1 多态性SSR 引物的筛选

从山西省选取共20 份糜子材料，从中随机选取6 份材料，用五、六碱基引物共14 对SSR 引物筛选，结果表明，10 对引物能够扩增出条带清晰、稳定性好、多态性高的引物（表3），可作为分子身份证构建的核心引物。其中，RYW1、2、3 为六碱基引物，RYW5、6、7、8、10、12、14 为五碱基引物。

表3 试验筛选出的SSR 引物的序列及退火温度Table 3 Sequence of SSR primers and annealing temperature

2.2 多态性引物遗传参数的分析

用筛选出的10 对多态性碱基引物扩增20 份糜子资源，由表4 可见，20 份材料在10 个位点共检测出等位变异10 个，每个位点检测到3 个（平均值为3.000 0）；其 中 有 效 等 位 变 异（Na）2.541 2（RYW2）~2.986 2（RYW1），平均值为2.808 8；Shannon 多样性指数（I）1.011 5（RYW2）~1.096 3（RYW1），平均值为1.063 3；观测杂合度（Ho）0.294 1（RYW7）~0.833 3（RYW2），平 均 值 为0.682 6；期望观测杂合度（He）0.623 8（RYW2）~0.684 1（RYW1），平 均 值 为0.662 4；Nei′s 基 因 多样 性 指 数（Nei）0.606 5（RYW2）~0.665 1（RYW1），平均值为0.643 3；多态性信息含量（PIC）0.571 1（RYW1）~0.796 2（RYW6），平均值为0.696 2。结果说明，10 对引物均具高度多态性（PIC>0.5）。

表4 10 个SSR 的遗传多样性参数Table 4 Genetic parameters of the 10 polymorphic SSR markers used in the study

2.3 糜子DNA 分子身份证的构建

高度多态性的10 对碱基引物RYW1、RYW2、RYW3、RYW5、RYW6、RYW7、RYW8、RYW10、RYW12、和RYW14 可用于区分糜子材料，通过排列组合方式，构建与糜子种质资源相应的字符串，进而编排成糜子DNA 分子身份证，得到山西省糜子分子ID（表5）。将糜子资源字符串输入条形码生成器中，生成相应的条形码分子ID。将糜子信息录入，利用二维码生成软件系统，生成糜子的二维码DNA 分子身份证（图1）。

表5 20 份糜子资源的字符串DNA 分子身份证Table 5 Character string molecular ID of 20 common mil⁃let germplasms

图1 20 份糜子材料条形码与二维码DNA 分子身份证Fig.1 Barcode and QR code DNA molecular ID cards of 20 common millet accessions

3 讨论

前人研究表明，国内不同生态区糜子资源的遗传多样性指数和多态性信息含量分别为0.859 9和0.457 3，国外糜子资源的遗传多样性指数和多态 性 信 息 含 量 则 分 别 为0.841 5 和0.427 9［21-22］。本研究的遗传多样性指数和多态性信息含量分别为1.063 3 和0.696 2，均高于前人研究结果，这可能与本研究使用的高基元SSR 有关，高基元SSR能够检测到低基元SSR 检测不到的变异，相较低基元SSR，高基元SSR 更为准确。

随着种质资源的频繁交流，种质混杂现象层出不穷，同时随着新品种的选育推广，种质资源准确鉴定和保护问题逐渐凸显。分子身份证能够有效区分地区和品种，且结果简单明了，能够广泛应用于大规模品种比对中［23］。分子身份证通过计算机进行自动比对，高效、准确。基于DNA 的分子身份证，是对种质资源在遗传分子层面上的区分鉴定，为种质资源鉴定提供了更加精准、科学的方法，同时为种质相关的知识产权的保护及利用提供了重要保障。分子身份证构建方法众多，除SSR 标记法外，常见的还有指纹图谱法，指纹图谱法通过对比电泳图判断物种个体差异，进而构建物种分子身份证。马琳等［24］用DNA 指纹图谱法构建了甘蓝型油菜的分子身份证，樊晓静等［25］通过SNP 标记构建茶树品种资源指纹图谱，构建了103 份茶树品种资源的分子身份证。指纹图谱虽然在检索种质资源时更加快速便捷，但指纹图谱法所得结果的条带多、数据统计及结果分析困难，在大规模鉴定品种上十分不便。基于此前人不断改进指纹图谱方法，如高源等［26］用基于TP-M13-SSR 指纹图谱的SSR 标记法构建了苹果的分子身份证，TP-M13-SSR 指纹图谱法虽改进了传统的指纹图谱法，但是此法所需试验仪器昂贵，对试验人员的专业能力要求较高，试验操作也更困难。SSR 标记法构建分子身份证技术成熟，操作简便。同时SSR 标记构建DNA 分子身份证编码方法多样，常见的有以下3 种类型：0/1 代码型根据凝胶电泳结果形成0、1 字符串［27］；等位基因编码型根据扩增的等位基因进行DNA 编码［28］；基因型编码型根据引物扩增的带型进行DNA 编码［29］。本试验采用0/1 代码型SSR 标记法编码，该方法变于统计、字符串长短适中。

SSR 是一类由1~6 个碱基组成的基序串联重复 而 成 的DNA 序 列，如（GC）n、（ATT）n 等 重复［30］。SSR 标 记 是 基 于PCR 技 术 的 一 种 分 子 标记［31］，其中引物则根据不同的SSR 标记而设计。前人选用不同的碱基引物构建了品种分子身份证，董翔等［32］用3 对二碱基引物构建莼菜的分子身份 证，张 嘉 等［33］利 用4 对 二 碱 基 引 物 构 建66 个 芍药品种的分子身份证。此外，部分研究将不同碱基相结合来构建品种分子身份证，郭艳春等［34］用1对单碱基、4 对二碱基、4 对三碱基、1 对四碱基和2对五碱基构建了61 份黄麻分子身份证，刘冠群等［35］用1 对二碱基、2 对三碱基、1 对五碱基和3 对六碱基对茶树品种进行分子身份证的构建。本研究用10 对五、六碱基引物（7 对五碱基、3 对六碱基）进行分子身份证的构建，筛选出的引物符合分子身份证构建所需要的碱基引物特征，同时高基元的碱基引物相较于低基元碱基引物，其试验检测效果好、多态性含量高，使得遗传差异的精确度大幅度提高。本研究所构建的分子身份证结合了先进条码技术，可用于商品包装，进而更好地管理种质资源。

4 结论

筛选出的10 对扩增稳定、多态性好的碱基SSR 引物对山西省的20 份糜子种质进行鉴定，将山西省的糜子种质品种及其近缘野生种和育成品种的信息资料进行分类汇总，构建了20 份糜子种质的条形码DNA 分子身份证和二维码DNA 分子身份证。