HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层的制备及体外生物活性

赵梦阳，黄紫洋

（福建师范大学化学与材料学院,福州 350007）

生物陶瓷因化学性能稳定、生物相容性优越，已被广泛应用于骨组织替代植入材料.目前，在我国人口老龄化的加速演进形势下，加快研发生物陶瓷医用材料和组织工程技术及骨替代产品，对提高人们的生活质量起到积极的作用.羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）作为生物活性陶瓷材料，其制备已经引起了化学、材料学和临床医学等领域研究者的极大兴趣，具有广阔的研究与应用前景［1~7］.骨组织中HA的组成和结构与天然HA矿物相近，是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机盐成分，HA具有优良的生物相容性和生物活性，可以促进成骨细胞增殖［3］，在生物医学领域具有巨大的应用潜力.然而由于HA初始断裂值较低［4］，不具备抑菌性，这严重制约其应用于承重部位骨骼损坏的修复与替代，因此开发新的加工技术，寻找添加剂以增强HA的力学性能和生物学性能显得尤为突出［5~7］.

Cu和Sr是人体骨骼中重要的成骨元素［8，9］.研究表明，乙二胺四乙酸铜（II）二钠盐（Na2Cu-EDTA）和HA/TiO2结合的复合涂层能够表现出较强的耐腐蚀性、抗菌能力和生物相容性［10］.通过水热法合成掺杂Sr的HA微球能够更好地促进细胞的增殖和分化［11］，有利于骨组织的修复.相关研究表明，一些金属盐或者其氧化物能够产生活性氧物种（ROS）并释放金属离子，两者的协同作用使材料具有一定的抑菌性［12］.壳聚糖（CS）是天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，带有正电荷基团［13］，在电场作用下能沉积至阴极表面，同时壳聚糖可在650℃下受热分解，已经被用作HA生物陶瓷材料的造孔剂［14，15］.在进行骨替代材料植入人体的手术过程中，经常会不可避免地引起细菌感染，造成的并发症威胁着患者术后的恢复.因此，设计一种具有一定抑菌性的生物陶瓷复合涂层材料是一个亟待解决的问题.本文采用先区带电泳分布，然后施予反向电场进行电泳沉积的方法（ZE/EPD），在Ti基材表面电泳沉积制得HA/CS/CuO/SrCO3复合涂层，然后在700℃下煅烧，得到一种在径向上具有一定梯度性质的HA/CuO/SrCO3复合涂层.该梯度复合涂层克服了HA涂层与Ti基材热膨胀系数不匹配的问题，有效提高了HA复合涂层与Ti基材的结合强度，同时由于在复合涂层中引入Cu和Sr两种成骨微量元素，改善了HA复合涂层的抑菌性能.因此，所制得的HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层有望开发成为新一代人工骨替代植入生物陶瓷材料.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

壳聚糖（CS，B.R.级，脱乙酰度80.0%～95.0%）、氯化钠、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钙、硫酸钠和溴化钾均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；正丁醇、三乙醇胺、无水乙醇、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸钠和氢氧化钠均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES，纯度99%）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；碳酸锶（SrCO3，纯度99%）和氧化铜（CuO，纯度99%），购自上海麦克林生化科技有限公司；实验用水均为二次蒸馏水；羟基磷灰石为实验室自制［16］.

Philis X'Pert MPD型X射线衍射仪（XRD，荷兰Phillip公司）；Thermo Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，美国Nicolet公司）；Phenomenon LE型场发射扫描电子显微镜（FESEM，荷兰Phenome⁃non公司）；LR5KPlus型劳埃德万能材料试验机（英国Lloyd公司）；CHI660E型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）.

1.2 HA/CuO/SrCO3复合涂层的制备

参考文献［17，18］的方法制备HA/CuO/SrCO3复合涂层.准确称量0.500 g HA，0.500 g CS，30.0 mg CuO，30.0 mg SrCO3并加入到50 mL正丁醇分散剂中，同时添加0.5 mL三乙醇胺作为乳化剂，超声分散1 h，静置陈化24 h以上，使用前再次超声分散1 h，如Scheme 1（A）所示.将预处理过的钛片作为正负极置于HA悬浮液中，相距3.0 cm，区带电泳电压36 V，电泳时间7 min，使悬浮液中各种带电颗粒在直流电场的作用下在分散剂中形成区带分布（ZE），如Scheme 1（B）所示.然后将正负极转换施以反向电场进行电泳沉积（EPD），即在原有的两电极Ti片中插入新的Ti片作为阴极，原阴极Ti片作为阳极，电泳沉积电压36 V，电极间距2.0 cm，电泳沉积10 min，如Scheme 1（C）所示.电泳沉积后从悬浮液中取出阴极Ti片，分别用正丁醇以及无水乙醇浸洗后，自然晾干得到HA/CS/CuO/SrCO3复合涂层，然后在700℃下煅烧2 h获得HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层，如Scheme 1（D）所示.同时采用相同的方法分别配制HA悬浮液、HA/CuO悬浮液、HA/SrCO3悬浮液和HA/CuO/SrCO3悬浮液，对以上未经区带电泳分布的悬浮液直接进行电泳沉积，煅烧后分别制得相应的HA涂层、HA/CuO涂层、HA/SrCO3涂层和HA/CuO/SrCO3涂层作为对比.

Scheme 1 Schematic diagram of the process for preparation of HA/CuO/SrCO3 composite coatings

1.3 HA/CuO/SrCO3复合涂层的表征

将煅烧前后的复合涂层从钛片表面剥离所得的粉末，用KBr压片制样，采用FTIR对样品进行表征.利用XRD表征复合涂层粉末的物相，检测条件为铜靶（λ=0.15418 nm），电压为40 kV，记录范围2θ=10°~70°.采用FESEM对复合涂层进行表面形貌的测试，同时使用FESEM附带的能量色散光谱仪（EDS）对复合涂层进行元素含量分析，工作电压为15 kV.

1.4 HA/CuO/SrCO3复合涂层与Ti基材结合强度的测试

如Scheme 2所示，以HA/CuO/SrCO3复合涂层为例，将复合涂层用AB胶粘结在经过除 油处理的实验室自制的不锈钢钩件上，粘合面积为1.00 cm×1.00 cm，固化15 d后，对复合涂层进行拉伸强度测试，拉伸速率为10 mm/min，预载荷为2.00 N，计算测得复合涂层与Ti基材的结合强度.同时测量其它条件下制得的复合涂层与Ti基材的结合强度.

Scheme 2 Schematic diagram of the bonding strength test for HA/CuO/SrCO3 composite coatings

1.5 HEPES模拟体液的配制

向1000 mL烧杯中加入700 mL二次蒸馏水，然后依次将6.670 g NaCl，5.955 g HEPES，2.268 g NaHCO3，0.305 g MgCl2·6H2O，0.279 g CaCl2，0.228 g K2HPO4·3H2O，0.224 g KCl和0.071 g Na2SO4缓慢加入二次蒸馏水中，期间不断搅拌至完全溶解.用1.0 mol/L NaOH调节溶液pH至7.40，最后用1000 mL容量瓶定容，即为HEPES模拟体液（H-SBF），将其置于低温暗处保存.

1.6 HA/CuO/SrCO3复合涂层的电化学性能测试

使用CHI660E型电化学工作站，采用三电极体系，以H-SBF作为电解液，用循环伏安（CV）法测试复合涂层在H-SBF中的CV曲线，用Tafel Plot法测试HA涂层、EPD法制备的复合涂层和ZE/EPD法制备的复合涂层3种复合涂层在H-SBF中的Tafel极化曲线.

1.7 HA/CuO/SrCO3复合涂层的体外生物活性测试

将煅烧后的复合涂层放入装有H-SBF的50 mL烧杯中，并置于温度为（37.0±0.1）℃的恒温水浴锅中分别培养8，16和24 d，每隔2 d更换一次H-SBF，实验结束后取出，用二次蒸馏水缓慢洗涤，室温下自然晾干后，再置于干燥器中备用.

1.8 HA/CuO/SrCO3复合涂层的抑菌性测试

分别采用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为探针，对HA/CuO/SrCO3复合涂层粉末进行抑菌性测试.在三角烧瓶里依次加入0.1 g复合涂层粉末、100 mL无菌水、1 mL菌培养液，封口后置于恒温培养振荡器中振荡24 h.取出100 μL在超净工作台上用LB（Luria-Bertani）固体培养基涂布，放入生化培养箱中恒温培养18 h后取出，用平板计数法统计LB培养基上的菌落数目，计算复合涂层的抑菌率.每个实验同时进行3组平行测试，根据测试结果计算平均抑菌率.实验同时以不加复合涂层粉末样作为空白对照.

2 结果与讨论

2.1 HA/CuO/SrCO3复合涂层的物相及化学组成

图1为HA/CS/CuO/SrCO3复合涂层在700℃煅烧前后剥离粉末的XRD谱图.可见，复合涂层粉末在2θ=25.9°，31.8°，32.2°，32.9°，34.0°，39.8°，46.7°，49.5°，50.5°，52.1°，53.1°，63.0°和64.1°处存在明显的XRD衍射峰，与HA标准卡片（JCPDS No.09-0432）相吻合［19］.实验结果表明，在电泳沉积过程中HA微粒沉积于Ti基材表面，掺杂的CuO和SrCO3两种成骨微量元素化合物以及在700℃高温煅烧使壳聚糖分解，对HA的晶型均未产生明显的影响.

Fig.1 XRD patterns of HA/CS/CuO/SrCO3 coatings before(a)and after(b)sintering treatment

Table 1 Element contents of HA/CS/CuO/SrCO3 coatings before and after sintering treat⁃ment*

Fig.2 FTIR spectra of HA/CS/CuO/SrCO3 coatings before(a)and after(b)sintering treatment

表1给出了HA/CS/CuO/SrCO3复合涂层煅烧前后的EDS元素分析结果.可见，煅烧前后都检测到了Cu和Sr元素，说明CuO和SrCO3微粒已经共沉积在Ti基材表面.通过FTIR对HA/CS/CuO/SrCO3涂层煅烧前后的剥离粉末进行表征.如图2所示，复合涂层煅烧后位于2920 cm−1处的亚甲基中C—H键的伸缩振动吸收峰以及位于1636 cm−1处的氨基N—H键的弯曲振动吸收峰几乎完全消失，从而进一步验证了复合涂层中的壳聚糖经700℃高温煅烧后氧化分解，佐证了壳聚糖适用于作为HA/CuO/SrCO3复合涂层的造孔剂［14，15］.

2.2 HA/CuO/SrCO3复合涂层截面的元素梯度分布

从HA/CuO/SrCO3复合涂层截面径向上等距离选取7点，依次对各点进行EDS测试分析，并得到相应的Ca，Cu和Sr元素的含量，取点位置关系如图3所示.将7个点的3种元素含量的数据依位置关系，拟合得到3种元素的含量与其所处位置的线性回归直线方程.如图4所示，经拟合得出复合涂层中径向上Ca元素的线性方程为：y1=1.650x+9.029，Cu元素的线性方程为：y2=−0.210x+1.601，Sr元素的线性方程为：y3=−0.625x+4.976.由图4可见，随着距离Ti基材径向上位置向外延伸，Ca元素的含量逐渐升高，Cu元素和Sr元素的含量逐渐降低，说明Ca，Cu和Sr元素在复合涂层中呈现梯度分布，即HA的含量由复合涂层内侧向外侧延伸逐渐增大，而CuO和SrCO3的含量由复合涂层内侧向外侧延伸逐渐减少，因此可得通过ZE/EPD方法制得的复合涂层中HA，CuO和SrCO3在其径向上具有一定的梯度分布性质.可能是由于在区带电泳分布过程中，带电微粒HA，CS，CuO和SrCO3在直流电场中的迁移速率受到颗粒本身的带电量、粒径和质量不同等因素的影响，所以不同微粒在向负极迁移的过程中速率不同，最终在悬浮液中形成具有浓度梯度的区带分布；接着在进行电泳沉积过程中，由于带电微粒在直流电场中定向迁移的速率不同和转换正负极前后的行程差，导致HA，CuO和SrCO3在复合涂层径向上产生梯度分布的现象［17，20］.

Fig.3 Location map of selected points of HA/CuO/SrCO3 coating in radial direction

Fig.4 Regression curves of the elemental contents of the HA/CuO/SrCO3 coating

2.3 HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层的表面形貌

图5 为HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层煅烧前后涂层表面的SEM照片.由图5（A）可见，HA/CS/CuO/SrCO3复合涂层的表面均匀致密，是由带同种电荷的HA，CS，CuO和SrCO3颗粒在电场的作用下均匀地沉积至负极Ti基材表面的结果.由图5（B）可见，复合涂层煅烧后的表面表面粗糙，凹凸不平，并且出现明显的沟壑，这是由于壳聚糖在700℃下受热氧化分解生成了CO2和H2O等气体留下的.这些沟壑为新骨的生成提供了物质交换通道［3］，有利于营养物质的交换［15］.

Fig.5 SEM images of HA/CS/CuO/SrCO3 gradient coatings before(A)and after(B)sintering treatment

2.4 HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层的结合强度

图6 为5种涂层与Ti基材的结合强度测试结果.可见，掺杂CuO和SrCO3后，可以一定程度提升涂层与Ti基材的结合强度，同时发现，采用ZE/EPD方法制得的梯度复合涂层与Ti基材的结合强度相比直接采用EPD方法所制得的无梯度分布复合涂层有显著的提升.这是由于在Ti基材内侧，粗糙的衬底表面与CuO和SrCO3颗粒在700℃的高温下形成了力学上的机械嵌合［21］，同时由于添加CuO和SrCO3颗粒在复合涂层中呈现梯度分布，缓解了复合涂层与Ti基材热膨胀系数的不匹配［22］，这些因素协同作用致使梯度复合涂层与Ti基材结合强度有了显著的提升.

2.5 HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层的耐腐蚀性

图7为HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层在H-SBF中的CV曲线.可见，在测试电势范围（−1.5～1.5 V，vs.SCE）内，梯度复合涂层的CV曲线未出现明显的氧化还原峰，表明梯度复合涂层在H-SBF中的电化学稳定性较强，即该复合涂层的电化学性能相对较为稳定，具有较强的耐腐蚀性，适用于作为人工植入材料.

Fig.6 Bonding strengths of five kinds of coatings with Ti substrate

Fig.7 CV curve of HA/CuO/SrCO3 gradient coating in H⁃SBF

Fig.8 Tafel polarization curves of three kinds of coatings in H⁃SBF

图8给出了HA涂层、无梯度分布复合涂层和HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层3种涂层在H-SBF中的Tafel极化曲线.表2汇总了由图8经过CHI软件分析计算得到的3种涂层的自腐蚀电位（Vcorr）和自腐蚀电流密度（Jcorr）.由图8和表2可见，相对单组分HA涂层，无梯度分布复合涂层和梯度复合涂层的自腐蚀电位均发生了正移，分别正移了0.113和0.483 V，说明梯度复合涂层的腐蚀倾向比其它2种涂层更难以发生.由表2还可见，梯度复合涂层的自腐蚀电流密度小于其它2种涂层，表明在发生电化学腐蚀时，梯度复合涂层的腐蚀速率小于其它2种涂层.以上电化学数据综合表明，梯度复合涂层的耐腐蚀性优于无梯度分布复合涂层，说明HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层在H-SBF中的耐腐蚀性更佳，更适合用作骨替代植入材料.

Table 2 Self-corrosion potentials and self-corrosion current densities of three coatings in H-SBF

2.6 HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层的体外生物活性

图9为HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层在H-SBF中恒温（37.0±0.1）℃下分别培养0，8，16和24 d的XRD谱图.可见，随着培养天数的增加，复合涂层中HA衍射峰的强度逐渐减弱，但衍射峰的位置却未发生变化.这是因为复合涂层在H-SBF培养过程中，HA中的OH−和被取代，复合涂层表面的HA发生了结构转变，转化为碳酸羟基磷灰石［Ca10−x（PO4）6−x（CO3）x（OH）2−x，0≤x≤2，CHA］［23］，从而增加了HA晶格的无序性，降低了HA的结晶度［24］，最终导致HA衍射峰强度的减弱.

Fig.9 XRD patterns of HA/CuO/SrCO3 gradient coating cultured in H⁃SBF for 0 d(a),8 d(b),16 d(c)and 24 d(d)

Fig.10 FTIR spectra of HA/CuO/SrCO3 gradient coating cultured in H⁃SBF for 0 d(a),8 d(b),16 d(c)and 24 d(d)

图10 为HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层在H-SBF中培养0，8，16和24 d的FTIR谱图.可见，位于3439 cm−1处的O—H伸缩振动吸收峰随培养天数的增加出现了弱化现象，位于569，604，964，1046和1094 cm−1处的伸缩振动吸收峰随培养天数的增加进一步变宽和减弱.可能是由于培养过程中HA中的和OH−与H-SBF中的进行离子交换而形成CHA，导致梯度复合涂层中磷酸盐的对称性降低.这一过程有助于梯度复合涂层吸收形成骨组织的血清蛋白，若将其作为植入材料，其必为骨组织的生长过程提供必要条件［25，26］.

图11（A）~（C）分别为HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层在（37.0±0.1）℃的H-SBF中培养8，16和24 d后复合涂层表面的SEM照片.可见，表面凹凸不平的梯度复合涂层在H-SBF中培养8 d后，复合涂层虽然表面大部分区域形成鳞片状或团粒状结构的物质，但涂层表面依然以粗糙、微团粒化及沟壑的形式存在.当梯度复合涂层在H-SBF中培养至16 d后，可以观察到圆形鳞片状结构的物质消失了，整个复合涂层表面被花瓣状结构的物质取代.当培养至24 d后，可以明显看到涂层表面出现了蠕虫状团粒结构的物质.这一系列的现象可能是由于在H-SBF培养过程中，复合涂层中HA的OH−和被H-SBF溶液中的取代，在复合涂层表面形成了团粒状的CHA，且CHA的大小随培养时间的增加而增长.由于沟壑附近有利于物质交换，CHA优先在梯度复合涂层沟壑处生成，从而为CHA的沉积提供质点，而CHA可以促进前成骨细胞增殖［27］，因此可以说明梯度复合涂层具有一定的体外生物活性，为植入体内的应用提供了实验数据.

Fig.11 SEM images of HA/CuO/SrCO3 gradient coatings cultured in H⁃SBF for 8 d(A),16 d(B)and 24 d(C)

2.7 HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层的抑菌性

Fig.12 Experiments of bacteriostatic rate of HA/CuO/SrCO3 coatings powder

将HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层从Ti基材表面剥离后，分别以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为探针，检测复合涂层粉末对细菌的抑制作用，抑菌性测试结果如图12所示.图12（A）和（B）为梯度复合涂层粉末对大肠杆菌的抑菌率结果，图12（C）和（D）为梯度复合涂层粉末对金黄色葡萄球菌的抑菌率结果，图12（A）和（C）为加入粉末的实验组，图12（B）和（D）为不加粉末的空白对照组.实验结果表明，梯度复合涂层粉末对大肠杆菌的抑菌率为81.82%，对金黄色葡萄菌的抑菌率为71.86%，如图13所示.由于HA本身不具备抑菌性，所以复合涂层粉末的抑菌性主要来自于CuO［28］.根据相关文献报道，CuO的抑菌机制主要是由于其能够诱导细菌产生活性氧物种（ROS）自由基［29］，改变了细菌细胞膜的通透性，从而使从CuO释放出的少量Cu2+更容易进入细胞内部，与细菌蛋白质结合致使细菌失活［30］，两者的协同作用使得掺杂CuO的复合涂层具有对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性［31］.

Fig.13 Inhibition rates of HA/CuO/SrCO3 composite coating powder against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 结 论

通过区带电泳分布后在反向电场作用下电泳沉积（ZE/EPD）制得HA/CS/CuO/SrCO3复合涂层，经700℃煅烧2 h后获得HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层.EDS测试表明，Ca，Cu和Sr元素的含量在梯度复合涂层径向上呈现梯度分布，说明采用ZE/EPD法制得的梯度复合涂层在其径向上，HA，CuO和SrCO3的含量具有一定的梯度性质；材料力学性能测试表明，梯度复合涂层与Ti基材的结合强度达33.0 MPa；电化学测试表明，梯度复合涂层在H-SBF中电化学稳定性较高，其自腐蚀电位为0.275 V（vs.SCE），自腐蚀电流密度为1.29 nA/cm2；通过XRD，FTIR和FESEM表征，佐证了梯度复合涂层在H-SBF中培养24 d后其表面HA发生碳磷灰石化；梯度复合涂层粉体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌率分别为81.82%与71.86%.HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层比直接采用电泳沉积制得的HA/CuO/SrCO3无梯度分布复合涂层具有更高的结合强度、较强的耐腐蚀能力、较优异的体外生物活性和抗菌活性.该HA/CuO/SrCO3梯度复合涂层有望开发成为骨替代材料用于治疗骨缺损，能够有效地防止细菌感染，诱导新骨生成，促进骨缺损处的骨增长和骨分化，使患者得以更快地恢复.