一种新型光致发光自愈合水凝胶的合成

周永辉，李 尧，吴雨轩，田 晶，徐龙权，费 旭

（1.大连工业大学实验仪器中心,2.生物工程学院,3.轻工与化工学院,大连 116034）

近年来，随着对水凝胶研究的深入，研究人员发现水凝胶通常具有优异的力学性能（包括韧性、强度、可恢复性和自愈性）、功能性和良好的生物相容性［1］，在医用材料领域已广泛应用于伤口治疗、组织支架和隐形眼镜等方面［2，3］.目前报道的生物医用水凝胶材料在更换时易被破坏，造成材料浪费.若能引入自愈合性质，使材料在受损后可快速愈合自身损伤，实现循环利用，则可以很好地解决上述问题.为了制备具有自愈合性质的水凝胶，科研人员提出了在水凝胶结构中引入动态物理相互作用和动态化学键的制备策略［4，5］.其中动态共价键具有非共价键所没有的可逆性，同时兼具共价键的稳定性.常用于制备自愈合水凝胶的动态共价键包括亚胺键［6，7］、酰腙键［8，9］、二硫键［10，11］和硼酸酯键［12，13］.在近几年的研究中，基于硫酸软骨素的自愈合水凝胶被开发并用于骨组织工程［14］，使用壳聚糖和纤维蛋白制成的自愈合复合水凝胶被用于构建血管网络［15］.但这些生物医学材料在生物体内使用时无法实时观测材料的位置与状态，极大限制了其应用.因此，赋予水凝胶良好的可识别性将极大地扩展其在生物医学领域的应用范围.

目前，发光水凝胶已作为一种功能化的平台用来实现各种基于荧光的应用，特别是在可穿戴的生物传感器和可植入的医疗装置等领域［16，17］.在生物医学应用中，发光水凝胶支架可实现体内实时或长期的监测［18］.水凝胶本身拥有优异的光学透明度和易被加工的特性，为其在光学方面的应用奠定了基础.将发光物质引入水凝胶体系中制备功能性发光水凝胶是一种高度可行的策略.许多发光材料在加入水凝胶体系后，它们在水凝胶中的分布、状态和响应性在亲水环境中不易控制.同时，凝聚在水凝胶体系中的发光材料彼此之间和与基材之间均会产生相互作用，这些作用会导致二次再吸附、光透射、光散射、反射和光转换等过程［19］.因此，从聚合科学的角度了解发光材料和水凝胶的微观结构特征，有助于进行功能性发光水凝胶的开发设计.尽管化学共轭、物理嵌入及新型印刷等技术已广泛使用，但在构建具有高度可控性的发光水凝胶方面仍然存在困难.

本文将4-乙烯基苯硼酸、N-乙烯基吡咯烷酮和含Eu稀土配合物［Eu（DBM）2（Phen）（MA）］（EDPM）进行自由基聚合，制备了光致发光的自愈合水凝胶.所制备的水凝胶中含有动态B—O—B键，其快速愈合特性可以使水凝胶在受损后能在短时间内恢复损伤.该水凝胶受损后在室温、不受外界刺激的条件下静置60 min，愈合效率可达到75%.同时，将油溶性的含Eu稀土配合物EDPM通过共价键引入水凝胶体系赋予了水凝胶良好的可识别性.这种拥有可识别性的自愈合水凝胶在智能可穿戴设备和生物医学领域拥有极大的应用潜力.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

4-乙烯基苯硼酸（96%）、N-乙烯基吡咯烷酮（99%）、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（99.9%）、一水合1，10-邻二氮杂菲（Phen，99%）、甲基丙烯酸（HMA，99%）、六水合氯化铕（EuCl3·6H2O，99.99%）、二苯甲酰基甲烷（DBM，99%）和二甲基亚砜（DMSO，99.5%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亚甲基蓝（99.5%）购自天津广福精细化工研究院；氢氧化钠（99%）购自天津科密欧化学试剂有限公司；95%乙醇（99%）和无水乙醇（99.5%）购自天津大茂化学试剂厂；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT，98%）购自上海爱德里奇化学有限公司；伊红染液（98%）和苏木精染液（98%）购自长春赛默瑞特科技有限公司；L929小鼠成纤维细胞购自中国科学院上海培养细胞库.高糖培养基（DMEM）、青霉素-链霉素溶液和胎牛血清（FBS）购自赛默飞世尔科技有限公司.所用试剂均为分析纯，未经过纯化直接使用.实验中使用的去离子水均由惠安特HAT-003-A型净水器制备.

BPN-50CH型万能试验机，英斯特朗仪器有限公司；JSM 7800F型扫描电子显微镜（SEM），工作电压5 kV，日本电子株式会社；ADVANCE NMR型核磁共振波谱仪（1H NMR），德国Bruker公司；INCA型能量色散X射线光电子能谱仪（XPS），工作电压15 kV，上海牛津仪器有限公司；FL920型荧光光谱仪，扫描范围385~395 nm，狭缝15 nm，美国Perkin Elmer公司；Spectra Max Plus 384型酶标仪，上海美谷分子仪器有限公司.

1.2 实验过程

1.2.1 稀土配合物EDPM的合成EDPM的合成过程如Scheme 1所示.将6.34 g（32 mmol）Phen和14.27 g（64 mmol）DBM加入盛有200 mL 95%乙醇的三口烧瓶中，加热至50℃，同时机械搅拌直到固体完全溶解；加入2.89 g（33.6 mmol）HMA，并通入N2气30 min以去除溶液中的O2气；将4.89 g（16 mmol）EuCl3·6H2O完全溶解于95%乙醇（50 mL）中后加入三口烧瓶中；用2 mol/L的NaOH乙醇溶液调节pH值至8，保持反应温度为50℃，机械搅拌10 h；使用无水乙醇多次洗涤产物以完全去除残留反应物，将产物真空干燥48 h，产率为67%.

Scheme 1 Synthetic route for the organic complex EDPM

1.2.2 聚-4-乙烯基苯硼酸-聚-N-乙烯基吡咯烷酮-聚-EDPM水凝胶（VNE水凝胶）的合成 将2.22 g（15 mmol）4-乙烯基苯硼酸，8.33 g（75 mmol）N-乙烯基吡咯烷酮、0.09 g（0.5 mmol）AIBN、0.09 g（0.5 mmol）N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、20 mL DMSO和0.13 g（0.15 mmol）EDPM混合在50 mL烧杯中；向混合溶液中通N2气并机械搅拌20 min，以除去溶液中的O2气；将混合溶液在75℃下加热固化4 h，得到VNE-1水凝胶.其它条件不变，改变EDPM的用量分别为0，0.26，0.53，0.78，1.03和1.26 g，制备另外5种水凝胶，分别命名为VNE-0和VNE2~VNE6.

1.2.3 VNE水凝胶的力学性能测试 所有水凝胶的拉伸测试均在室温（25℃）下使用万能试验机进行.将VNE水凝胶样品制备成长方体（80 mm×20 mm×5 mm）进行拉伸测试，拉伸速率为5 mm/min.

1.2.4 VNE水凝胶的自愈合性能测试 将VNE水凝胶制备成规则的圆柱体（φ20 mm×5 mm）.将水凝胶样品平均切为两段，其中一段样品使用亚甲基蓝进行染色.将两段水凝胶的断面完全重合在一起进行自愈合.同时进一步测试VNE水凝胶自愈合行为对于pH的依赖性.将VNE水凝胶样品分别在酸性（pH=5）、中性（pH=7）和碱性（pH=9）条件下浸泡1 h；将浸泡后的水凝胶平均切为两段，其中一段使用亚甲基蓝染色.将两段水凝胶断面完全重合在一起进行自愈合.以上自愈合测试均在室温（25℃）、不受任何外力的影响下进行.

1.2.5 VNE水凝胶的细胞毒性分析 在37℃和5%CO2的环境中，将L929小鼠成纤维细胞在89%高糖培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液中复苏，形成细胞悬浮液.将1 mL细胞悬液（1×104cell/mL）与30 mg无菌VNE水凝胶共同培养24 h；培养结束后去除培养基，使用苏木精将细胞染色，染色后使用4倍显微镜观察细胞生长情况.通过MTT法评估VNE水凝胶的细胞毒性.将5 mg MTT溶于1 mL细胞培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，形成MTT溶液.将30 mg无菌VNE水凝胶置于96孔板中（3个平行样品），加入1 mL浓度为1×104cell/mL的细胞悬液，将细胞与水凝胶放入培养箱，在37℃，5%CO2的环境下共培养24 h.然后加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），将上述平板置于37℃，5%CO2的培养箱中培养6 h，形成结晶甲瓒.随后移除培养基，向每个带有凝胶的孔中加入150 μL DMSO溶液溶解MTT，振荡15 min.使用酶标仪在490 nm下测量溶液OD值.孔板中不放置凝胶只接种浓度为1×104cell/mL的细胞悬液为对照组；取3个样本的平均值结果.

1.2.6 VNE水凝胶的溶胀性能测试 将3个圆柱体（φ10 mm×3 mm）的VNE水凝胶样品室温下浸泡于去离子水中进行溶胀性能测试.间隔相同时间测定样品质量，平衡后用滤纸轻轻吸去VEN水凝胶样品表面的水并称重.膨胀比（G，%）定义为：

式中：m0（g）为水凝胶样品的初始质量，m1（g）为水凝胶吸水后的质量，结果取3次测试的平均值.

2 结果与讨论

2.1 VNE水凝胶的制备与表征

VNE水凝胶的合成机理如Scheme 2所示.与之前报道的基于小分子苯硼酸动态共价交联的自修复水凝胶不同，本文利用动态共价键将活性官能团O—B通过共价键聚合到聚合物链中形成水凝胶.硼酸自聚合形成的动态B—O—B键不仅能提高水凝胶的稳定性，同时又具有可逆性质，能够在短时间内快速愈合损伤，共价交联的方式避免了苯硼酸分子的扩散.此外，将油溶性含Eu稀土配合物EDPM以共价交联的方式聚合到凝胶链中可赋予VNE水凝胶优良的光致发光性能.

Scheme 2 Synthesis mechanism of VNE hydrogel

首先成功合成了VNE水凝胶.由图1（A）可见，VNE-0水凝胶为黄色透明的胶体，在黑暗处使用波长为385 nm的紫外光照射时发出淡蓝色荧光.这是因为VNE-0水凝胶中含有苯硼酸，其可在紫外光下发出淡蓝色光.波长较短的紫外光可顺利地穿透B—O键，这是由于B原子和O原子间的电负性相差较大.同时，具有较高结合能力的B—O键形成的阴离子基团不易输出电子，因此硼酸基发光材料表现出较高的抗光损伤阈值，以苯硼酸为基材制备出的VNE水凝胶发光性能良好.由图1（B）可见，含有EDPM的VNE-4水凝胶在黑暗处用紫外光照射时发出明显的红色光，这是由于VNE-4水凝胶中的含Eu稀土配合物EDPM在紫外光下可发出明显可识别的红光.

图2为EDPM的1H NMR谱图.图2中δ3.34，2.50处分别为水和DMSO溶剂的特征峰；δ9.12，8.51，8.00，7.80处的峰分别对应二苯甲酰甲烷上的氢（图2中1，2，4，5）；δ8.19，7.67，7.56，7.20，3.12处的特征峰分别对应邻菲罗啉（Phen）上的氢（图2中3，6，7，8，12）；δ6.83，6.71，5.75处的特征峰对应的是甲基丙烯酸上的氢（图2中9，10，11）.以上结果说明有机配体与Eu3+成功配位.

图3为EDPM，VNE-0及VNE-4的红外光谱.图3中EDPM在3050~3016 cm−1处的吸收峰归属为苯环的C—H伸缩振动峰，1597~1515 cm−1处的吸收峰归属为苯环骨架振动峰；2963~2857 cm−1处的特征吸收峰归属于—CH3和—CH2—的伸缩振动；1731 cm−1处的吸收峰归属于—C=O的伸缩振动；1622 cm−1处为—C=C—的特征吸收峰，表明甲基丙烯酸与Eu3+成功配位，双键被成功引入到EDPM中.通过EDS能谱分析了EDPM的元素组成.由图S1和表S1（见本文支持信息）可以看出特征元素Eu的存在，进一步证明EDPM被成功合成.

Fig.1 Photographs of VNE⁃0(A)and VNE⁃4(B)hydro⁃gels without and with UV⁃light irradiation

Fig.2 1H NMR spectrum of EDPM

在不含EDPM的VNE-0水凝胶中，苯骨架的振动峰出现在1500~1540 cm−1处，1700 cm−1处的吸收峰归属于—C=O振动，在3410 cm−1处宽而强的吸收峰归属于O—H的拉伸振动，1350~1310 cm−1处的吸收峰是由4-乙烯基苯硼酸中B—O键的伸缩振动引起的，2960~2850 cm−1处的吸收峰是由—CH3和—CH2—引起的.以上结果表明，4-乙烯基苯硼酸和N-乙烯基吡咯烷酮已成功引入VNE水凝胶聚合物分子链中.

含EDPM的VNE-4水凝胶样品在3410 cm−1处的强峰归属于O—H拉伸振动.1500~1540 cm−1处为苯环骨架的伸缩振动吸收峰.4-乙烯基苯硼酸中苯骨架的振动发生在1675~1500 cm−1之间，1350~1310 cm−1之间的伸缩振动吸收峰是由B—O键引起的.其它VNE水凝胶的红外光谱（图S2，见本文支持信息）与VNE-4水凝胶规律相同，并且随水凝胶中EPDM含量增加，其特征峰的峰面积逐渐增大.这说明经自由基共聚后，含Eu稀土配合物EDPM和4-乙烯基苯硼酸被成功引入到VNE水凝胶中.

Fig.3 FTIR spectra of the Eu⁃containing organic complex EDPM and VNE hydrogels

Fig.4 SEM image of the VNE⁃4 hydrogel(A)and statistics on pore diameter sizes of VNE⁃4 freeze⁃dried hydrogel after swelling(B)

许多生物医学材料应用需要水凝胶具有特定孔径和平均分布的网状结构.孔隙度的层次结构使得不同分子维度的化学物质都能够选择性地进出.多孔的层次结构便于与不同尺寸的基质（如小分子、生物大分子甚至纳米颗粒）相互作用.图4（A）给出冷冻干燥后的VNE-4凝胶的SEM照片.由图4（A）可以看出，VNE-4水凝胶呈现多孔网状结构，凝胶的形貌得到了很好的保留，从插图可以清晰地看到水凝胶表面光滑多孔，具备典型的凝胶结构.由图4（B）可以看出，VNE-4水凝胶的孔径在3.33~11.67 μm之间，其微观多孔的网状结构为大分子的传递提供了必要的条件.由图5的水凝胶表面元素分布结果可看出，VNE-4水凝胶中Eu和B元素含量分别为17.92%和5.29%，表明EDPM和4-乙烯基苯硼酸已经成功聚合到VNE水凝胶中.

Fig.5 Elemental content of VNE⁃4 hydrogel

2.2 VNE水凝胶的力学性能

图6 （A）为VNE-4水凝胶的拉伸测试结果.可见，VNE-4水凝胶在拉伸过程中产生了明显形变.由图6（B）可看出，在拉伸过程中使用紫外光照射时VNE-4水凝胶发出明显的红光，说明EDPM在水凝胶体系中稳定存在.

Fig.6 Photos of VNE⁃4 hydrogel before(left)and after(right)stretching(A)and irradiated with UV during stretching(B)

由图7可见，VNE-4凝胶的拉伸强度可达9.46 kPa，最大断裂伸长率可达33.04%，并且经过1 h自愈合过程的VNE-4凝胶的拉伸强度可达7.16 kPa，最大断裂伸长率可达26.83%，拉伸强度与伸长率均可恢复至初始的75%以上，这说明该水凝胶具有良好的自愈合性能.当水凝胶受到外力作用发生破损时，其分子链间的网络可在硼酸酯键的作用下进行重组，即进行自愈合过程.VNE水凝胶的这一特性提升了其在实际应用中的可靠性和稳定性.

2.3 VNE水凝胶的自愈合性能

在VNE水凝胶体系中，4-乙烯基苯硼酸之间存在动态的硼酸酯键，赋予了VNE水凝胶快速自修复性能.水凝胶在受到损伤后不需要外部刺激，可以通过动态B—O—B键实现自行修复.由图8可见，将水凝胶平均分为两半，将其中一半使用亚甲基蓝染色，然后将两块水凝胶的切口完全重叠接触，在不受任何外界刺激的环境下放置30 min，两块水凝胶接触界面逐渐模糊，直至切口消失.使用镊子从一端夹起愈合的水凝胶，水凝胶可以承受自身的重力而不会发生断裂，这说明VNE凝胶已自发愈合了受到的损伤.将愈合好的水凝胶重新切开，可以重复之前的愈合过程，并且愈合时间相同，说明VNE水凝胶的自愈合行为稳定、可重复.

在4倍显微镜下观察了VNE-4水凝胶的自愈过程.由图9可见，VNE水凝胶在不受外力的情况下可自发修复损伤，随着愈合时间延长，水凝胶表面的划痕越来越浅，在60 min时划痕消失，说明水凝胶损伤已完全修复.VNE水凝胶可自愈合是由于水凝胶中含有动态可逆硼酸酯键，在切口处断开的硼酸酯键转变为游离苯硼酸基团，将断面连接时又重新形成了硼酸酯键，从而实现水凝胶的自愈合.

Fig.7 Strain curves of VNE⁃4 hydrogel before(a)and after(b)healing

Fig.8 Photos of self⁃healing process of dyed VNE⁃4 hydrogel

硼酸酯键是一个动态化学键，由于pH值会影响平衡常数，因此水凝胶的自愈合性能会受pH值影响.将VNE-4水凝胶在不同pH值的去离子水中浸泡1 h，然后将其切半染色进行自愈合，观察现象以确定pH值对VNE-4水凝胶愈合的影响.由图10可见，当pH值为5，6和7时，水凝胶均不能自愈合；而当pH值为8和9时，VNE水凝胶可以自愈合.更重要的是，EDPM的光致发光特性对碱性环境具有依赖性，VNE水凝胶在紫外光照射下仍能发出红光，但处于酸性条件时，荧光强度随着pH值的减小而降低.结果表明，在碱性条件下水凝胶断面处的硼酸酯键可重新建立，从而实现自愈合.

Fig.9 Photos of self⁃healing process of VNE⁃4 hydrogel under microscope in 0(A)20(B),40(C)and 60 min(D)

Fig.10 Self healing conditions of VNE⁃4 hydrogels soaking in deionized water with different pH values

2.4 VNE水凝胶的荧光性能

含Eu稀土配合物因其红光发射窄、荧光寿命长等优点，已应用于红色有机发光二极管、激光和生物传感器等领域.图11为VNE-1~VNE-6和EDPM的荧光发射光谱.可以看出，图中的7组荧光光谱在614 nm处都有尖锐的强发射峰，为偶极子诱导的Eu3+的5D0→7F2跃迁的特征荧光发射.EDPM稀土配合物共有5个发射峰，分别对应Eu3+的5D0→7FJ（J=0~4）跃迁发射.在385 nm的紫外光激发下，EDPM稀土配合物发出强烈的红色荧光，最大荧光强度可达856，且荧光颜色稳定.从图11可以看出，VNE-4水凝胶在低浓度下仍具有最高的荧光强度.由于VNE水凝胶在有机相（DMSO）中制备，配合物的发光性能得到了很好保留.但是由于EDPM稀土配合物的发光特性对碱性条件具有依赖性，因此当水凝胶体系中存在酸性的4-乙烯基苯硼酸时，荧光强度有所下降.随着EDPM的加入量逐渐增大，水凝胶的荧光强度也逐渐增大，VNE-4水凝胶的荧光强度最高，达到了642，当EDPM在水凝胶中占比继续增大时，荧光强度却出现下降.这是因为当荧光物质浓度过大时，会产生荧光猝灭导致荧光强度下降.

Fig.11 Emission spectra of Eu⁃containing polymers EDPM and VNE hydrogels

由图12可见，在鸡皮包覆的情况下使用紫外光照射，仍能够观察到穿透鸡皮的强烈红光.这证明了含Eu稀土配合物EDPM被成功引入到VNE水凝胶中，同时赋予了水凝胶优异的光致发光性能.为VNE水凝胶作为可识别的皮下植入生物医用材料提供了可能.

Fig.12 Photos of VNE hydrogel covered with chicken skin under UV irradiation

2.5 VNE水凝胶的细胞毒性

以小鼠的成骨纤维细胞（L929）为原料，通过MTT法检测VNE水凝胶潜在的细胞毒性.图13（A）为细胞在VNE-4水凝胶上培养72 h的细胞相对活性结果.从图13（A）可以看出，在VNE-4水凝胶上培养后，细胞的相对活性仍在95%以上，说明VNE-4水凝胶对细胞无明显毒害作用.图13（B）为细胞经苏木精-伊红染色后在4倍显微镜下观察的照片.细胞经染色后，活细胞的细胞核可被直观观察到，从而可观察出活细胞数量.从图中可以看出大量纺锤状的L929活细胞，而且细胞的表面形态并未发生明显的改变.以上结果均说明VNE水凝胶对细胞无毒性.

Fig.13 Cell viability(A)and optical image(B)of L929 mouse fibroblasts cultured with VNE⁃4 hydrogel under microscope

3 结 论

开发了一种具有快速自愈合性能和光致发光特性的新型水凝胶.基于动态的硼酸酯键，VNE水凝胶在受外力破坏后，在不受任何外界刺激的条件下可在1 h内完全愈合.由于在水凝胶内引入了含Eu稀土配合物EDPM，VNE水凝胶在保持高透明度的同时，在紫外光照射下也可表现出明显的荧光响应.在波长为385 nm的紫外光激发下，VNE水凝胶发出强烈的红光，表现出优异的可识别性.实验证明EDPM通过共价键被引入水凝胶体系中，在VNE水凝胶中稳定存在并且不易脱落与分解，使VNE水凝胶始终保持光致发光特性.VNE水凝胶的拉伸应力可达9.46 kPa，最大断裂伸长率可达33.04%.细胞毒性实验显示VNE水凝胶对细胞无毒.这种兼具快速自愈性及可识别性的VNE水凝胶在生物影像、生物材料及荧光标记等领域具有广阔的应用前景.

支持信息见http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20210606.