黄病毒科和冠状病毒科病毒侵染中的外泌体研究进展*

任永雯 李鹏 张磊亮

（山东第一医科大学（山东省医学科学院）基础医学研究所，济南 250062）

1 外泌体

外泌体是大小为30～150 nm的膜包裹细胞外微泡，属于一种细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）［1］。它 是 由 多 泡 体（multivesicular body，MVB）通过内体途径分泌的小泡，存在于各种体液中，如血液、精液、脑脊液、羊水、腹水、胆汁和母乳等。它在细胞间通讯、免疫调节和病毒传播中起重要作用，具有与其他细胞外囊泡，如微泡、迁移体、凋亡体等不同的特点。但是，在不同的研究领域，囊泡的命名和分类存在着混淆和巧合，这有待研究人员用统一的标准给予细胞外囊泡分类。

外泌体起源于多泡体，而这些多泡体从早期的内体中萌芽。早期内体形成多泡体的发育过程分为4个阶段：内吞囊泡结构、前多泡体、苍白的多泡体和致密的多泡体（又称晚期核内体）［2］。成熟核内体包含的腔内小泡（intraluminal vesciles，ILVs）有两种不同的命运：a.与质膜融合并将ILVs释放到细胞外环境的囊泡，称为外泌体；b.未与质膜融合的MVB将与胞内溶酶体结合，最终被降解［3］。

外泌体能够同时携带胞内和胞外物质，这可能与运输需要的内体分选复合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）机制 有关，因此，Alix和TSG101等ESCRT蛋白在外泌体中富集作为外泌体的标志物［4-5］。在外泌体中也检测到其他蛋白质，如脂质运输相关蛋白，转铁蛋白和小泡蛋白，以及膜运输相关蛋白，CD9、CD63和CD81等，它们进入外泌体也需要ESCRT机制的分选［6-7］。然而，运用ESCRT机制并不是细胞内外物质进入外泌体的唯一方法，蛋白质、脂质和RNA亦可以通过许多其他机制进入外泌体，如神经酰胺途径［8］和四跨膜蛋白复合物的寡聚化［9］。

2 外泌体在黄病毒科病毒感染过程中的作用

黄病毒科病毒是单股正链包膜RNA病毒，直径大约50～70 nm［10］，包括许多重要的人类病原体如登革病毒（Dengue virus，DENV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）、西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）和 兰 加 特 病 毒（Langat virus，LGTV）等［11］。大多数黄病毒科病毒通过吸血的节肢动物（如蚊子、蜱虫等）传播，在世界范围内引起各种新发和再发传染病，从而对全球公共卫生造成严重负担［12-13］。例如，2015年在巴西暴发过寨卡病毒疫情［14］，近年来在某些地区发生了日本脑炎病毒和西尼罗病毒的流行［15］。有研究估计，世界上有40%以上的地区面临黄病毒科病毒感染的风险。迄今为止，除丙肝病毒外，临床治疗黄病毒科病毒感染还没有特异性的抗病毒药物［16］。因此，抗黄病毒科病毒感染的研究仍然极为迫切。

外泌体起源于内体，而一些黄病毒科病毒如丙型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒和西尼罗病毒则可以进入晚期内体［17-18］，这或许是病毒蛋白和RNA被分选进入外泌体的原因之一。例如，丙型肝炎病毒基因组RNA可以进入外泌体，并且该外泌体具有感染性［19］。携带病毒蛋白和RNA的外泌体不仅被赋予了新的生物功能，还能影响宿主免疫应答。但是，病毒蛋白和RNA进入外泌体的机制尚不明确。重要的是，外泌体介导了病毒与宿主的相互作用，这将为外泌体成为抗病毒治疗的有效靶点提供重要的理论依据。

2.1 登革病毒

DENV是一种重要的由节肢动物传播的黄病毒科病毒，分为DENV1～4共四个血清型，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，引起从无症状到头痛、全身肌肉疼痛、休克和典型的登革热等症状［20-21］。DENV与外泌体的密切关系近年来才为人所知，来自感染DENV细胞的外泌体可以通过介导细胞间的信息交流，从而影响DENV传播。

Vora等［22］从感染DENV2或3的白纹伊蚊和埃及伊蚊体外细胞系中分离出的细胞外囊泡（包括外泌体）中发现了病毒RNA、E蛋白和完整的DENV基因组，这些EVs具有传播到蚊子和哺乳动物细胞的能力。进一步研究发现，DENV2感染上调了与E蛋白直接相互作用的四跨膜糖蛋白Tsp29Fb的表达。用外泌体产生和释放的抑制剂GW4869处理细胞后，不仅减少了宿主细胞及细胞外囊泡中病毒载量，还削弱了Tsp29Fb与E蛋白相互作用，更直接影响了EVs介导的病毒RNA和蛋白质向人类细胞的传递［22］。鉴于细胞外囊泡可分为不同类型，其在病毒感染过程中具有重要作用，Reyes-Ruiz等［23］在此基础上进一步研究了外泌体与DENV的关系，感染DENV的节肢动物C3/36细胞分泌的外泌体呈“杯状”结构，与人类细胞的外泌体类似，含有四跨膜蛋白AalCD9和AalCD81，也含有GAPDH等宿主蛋白。他们还发现，DENV感染的C3/36细胞分泌的外泌体体积大于来自未感染细胞的外泌体，是因为这些外泌体内有约55 nm的球形病毒样颗粒，该外泌体纯化后具有感染潜力，可以再次感染C3/36细胞。这些证据表明，外泌体是DENV进行细胞间传播的新途径。

在外泌体介导的抗病毒方面，宿主细胞RNA和蛋白质参与的抗病毒作用已在DENV感染细胞分泌的细胞外囊泡/外泌体中被发现。有文献报道，感染DENV3的树突细胞分泌的小EVs（＜200 nm）同样呈“杯状”，不仅含有四跨膜蛋白（CD9、CD81、CD63）和一些病毒组分，还包含一些miRNA（如miR4327、miR1246、miR1261、miR142等）和39种mRNA（如RPS13、GSTT1、COX7C、GRHPR、TXNL4A、NDUFB7、DDX58、IFIT1和IFITM1等）［24］。这里的EVs与上述外泌体具有类似的特点以及内容物，但是否为外泌体，作者并未指明。

存在于DENV感染细胞内的miRNA，作为生物标志物可以被EVs释放。其中，miR4327仅可在DENV急性感染或者在出血型DENV3-5532株的病人中检测到，而在轻型DENV3-290株感染患者、流感病毒感染患者、DENV感染康复者和健康者体内无法检测到，使得miR4327有可能成为检测DENV严重感染的特异性标志物。此外，EVs中的这些mRNA通常可以编码辅助建立抗病毒反应的蛋白质或者直接抵抗病毒感染的蛋白质，受体细胞可以利用EVs蛋白免受病毒感染。Zhu等［25］则详细验证了干扰素诱导的跨膜蛋白3（interferoninducible transmemberane protein，IFITM3）在抑制包膜病毒进入、调节病毒受体表达等方面的作用。IFITM3被证实存在于细胞外泌体中并可被外泌体释放到细胞外。当宿主细胞被DENV2感染，IFITM3可以通过外泌体从感染细胞传递到非感染细胞，从而抑制DENV的进入与感染。另外，干扰素处理后的EVs也可以保护其他细胞免受DENV感染［24-25］。另外，CLEC5A（一种针对黄病毒科病毒和细菌的模式识别受体）和CLEC2（活化血小板的蛇毒聚集素受体）是脾酪氨酸激酶（Syk）偶联的c型凝集素受体，分别在白细胞和血小板中大量表达。DENV通过激活CLEC2促进血小板释放外泌体和微泡，DENV诱导的外泌体可激活中性粒细胞和巨噬细胞上的CLEC5A和TLR2，诱导中性粒细胞胞外陷阱的形成和促炎细胞因子的释放。动物实验证明，阻断CLEC5A和TLR2可有效减弱DENV诱导的炎症反应，该研究将有助于开发新的急性病毒感染的治疗方法［26］。

在蚊子细胞内，DENV可以利用外泌体途径促进感染，而哺乳动物细胞可以通过这种途径向邻近细胞传递信号进行抗病毒免疫反应以维持细胞自我稳定。蛋白质、mRNA和miRNA等物质可通过外泌体被运输到邻近细胞或远区细胞以调节细胞的各种生理和病理过程，因此外泌体将有可能作为抗病毒感染以及预防病毒感染的极佳手段。这些研究为未来以外泌体为靶点的抗病毒研究发展提供重要的理论依据且具有很强的现实价值。

2.2 寨卡病毒（ZIKV）

ZIKV自从南美洲暴发以来，蔓延到了许多地区，使得数百万人被感染。虽然大多数患者无症状或症状轻微，但是部分感染可影响中枢神经系统和外周神经系统，引起严重的神经并发症，如脑膜炎和格林-巴利综合征［27］。

ZIKV利用外泌体为媒介在神经元细胞间进行传播。与DENV感染细胞产生的外泌体类似，ZIKV感染促进小鼠神经元细胞释放的外泌体，其体积大于来自未感染细胞的外泌体，并含有ZIKV RNA和E蛋白，对幼稚皮质神经元细胞具有高度传染性。有趣的是，外泌体内的ZIKV RNA在中枢神经系统的幼稚皮质神经元细胞内不仅具有传染性，还具有活性和可复制性。进一步研究表明，在ZIKV感染后，神经元外泌体产生和释放的调控取决于于中性鞘磷脂酶（nSMase）-2/SMPD3是否被激活并表达。因此，使用抑制剂GW4869或沉默SMPD3可以降低皮层神经元外泌体介导的病毒传播和病毒载量［28］。该研究为理解外泌体在ZIKV感染中的重要性提供了一个新的观点。

外泌体可以介导抗ZIKV感染。干扰素和内源性防御素等天然免疫蛋白是机体抵抗病原体入侵的第一道防线，可以预防多种病毒感染，如：人类免疫缺陷病毒、甲型流感病毒、人类乳头瘤病毒等。IFN-β已被证明可以诱导一些lncRNA，进而调节宿主天然免疫反应和自然杀伤（NK）细胞的活性。IFNβ诱导A549细胞产生的外泌体能进入NK细胞，外泌体货物linc-EPHA6-1作为hsa-miR-4485（与NKp46的3'UTR互补结合，调节NKp46的表达）的竞争性内源RNA，上调NK细胞受体（NKp46）表达，增强NK细胞毒性，抵抗ZIKV感染A549细胞［29］。另外，最近有研究发现：外泌体介导的防御素α1B（defensin alpha 1B，DEFA1B）可以抗ZIKV感染。相较于未感染ZIKV的A549细胞，感染细胞产生外泌体DEFA1B的mRNA水平明显升高，并且在HEK293T细胞中转染质粒证明：DEFA1B以剂量依赖的方式抑制ZIKV复制。进一步研究发现，DEFA1B能与原点识别复合体1（origin recognition complex 1，ORC1）相互作用并阻止ORC1进入细胞核，抑制DNA复制从而延缓细胞周期。由于延缓的细胞周期与神经发育相关［30］，而作为蛋白质转运载体的外泌体很容易穿过血脑屏障和胎盘屏障［31-32］，那么这种现象可能与ZIKV感染造成的小头症有关。有趣的是，A549细胞分泌的含有DEFA1B的外泌体能被HEK293T和SH-SY5Y细胞内化，从而将延缓细胞周期的作用传递给受体细胞［33］。

内源性限制因子IFITM3不仅能抑制DENV感染，还能抑制ZIKV进入宿主细胞并抑制病毒复制［34］；IFITM3外显子定位于溶酶体或晚期内体，EVs传递的外源IFITM3通过内溶酶体转运并阻断病毒进入。相反，含有IFITM3突变体的EVs不能有效地传递到内溶酶体，不能抑制病毒复制或保护细胞免受感染。此外，胎盘中IFN刺激基因（ISG）的组成性表达，包括IFITM1和IFITM3，被认为是保护发育中胎儿免受病毒感染的内在机制。然而，与胎盘相比，发育中胎儿器官的IFITM水平较低［35］，为ZIKV在胎儿中复制提供了机会。动物实验证明，外泌体能有效穿过胎盘屏障传递IFITM3抑制胎儿体内ZIKV的复制并减轻小鼠母体和胎儿的病毒血症，并且外泌体IFITM3不会对怀孕的小鼠和胎儿造成不良影响或产生有害的免疫反应［36］。该研究为以外泌体为载体控制宫内感染提供了可能性。

唾液是ZIKV在人与人之间传播的可能来源，因为病毒会进入唾液。研究人员发现，生理浓度的混合唾液通过阻止病毒黏附到靶细胞而剂量依赖性地抑制ZIKV感染猴和人细胞。唾液中的抗ZIKV活性不能通过煮沸来消除，这表明抗病毒因子不是一种蛋白质；因此他们发现是唾液中的细胞外囊泡（包括外泌体）以生理浓度阻止ZIKV与靶细胞的黏附和感染，从而可以抑制ZIKV感染。需要注意的是，唾液的抗ZIKV活性是保守的，但抑制程度因个体而异［37］。这项研究为未发现ZIKV通过唾液传播的原因提供了一个合理的解释，并且证明口腔先天免疫防御机制对抗某些病毒病原体有重要作用。

根据以上研究报道，外泌体作为一种将新颖有效并安全的抗病毒策略，不仅转运病毒组分以及抗病毒物质（表1），而且影响受体细胞或组织的生理功能以及免疫应答，为穿过各种生物屏障抵抗病毒感染提供了有效工具。

2.3 丙型肝炎病毒（HCV）

HCV属于黄病毒科肝炎病毒属，是慢性肝炎的主要病因之一。据统计，全世界约有7 100万人感染HCV，自2012年起，中国发病人数每年约20多万。长期慢性HCV感染常导致多种肝脏疾病，包括脂肪变性、肝硬化和肝细胞癌［38］。科学研究表明，来自HCV感染细胞的外泌体含有病毒RNA并促进新的感染。

与其他黄病毒科病毒类似，在HCV感染细胞产生的外泌体中也发现了病毒包膜蛋白以及病毒RNA。HCV感染Huh7.5.1细胞，病毒蛋白E2除了可以组成感染性HCV颗粒，还被外泌体携带在囊泡表面；该类外泌体具有降低HCV对E2特异性抗体的敏感性，协助HCV逃避中和抗体的作用［39］。而在HCV患者血浆和HCV感染的肝细胞上清液中分离出的外泌体含有病毒RNA，可以驱动单核细胞向髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）分化，进而促进T滤泡调节细胞的调节分化并抑制T滤泡辅助细胞的功能。这种MDSCs介导的T细胞失调使得外周血中T滤泡调节细胞/T滤泡辅助细胞的比率以及IL-10的产生增加。而经过抗病毒治疗的患者血浆分离的外泌体则不含病毒RNA，也无法诱导髓源性抑制细胞的分化。另外，HCV感染细胞分泌的外泌体可以抑制健康髓细胞miR-124的表达［40］。这项研究揭示了HCV感染期间免疫失调的新机制。

microRNA（miRNA）是外泌体的重要成分之一，不仅能够调节基因表达，还可以介导宿主抗病毒免疫反应。Kim等［41］前期研究发现，HCV侵染肝细胞能诱导miR-192表达，从而上调转化生长因子β1（TGF-β1）。他们发现，外泌体将miR-192从病毒复制的肝细胞传送到肝星状细胞；在肝星状细胞中，miRNA通过上调TGF-β1来上调肝纤维化标志物COL1A1和a-SMA等表达，造成肝星状细胞被激活并分化为成纤维细胞。相应的，如果将HCV侵染的肝细胞用抗miR-192处理，那么将不仅降低外泌体内的miR192，还抑制肝星状细胞的分化。另有一项研究［42］阐明了外泌体miRNA与利妥昔单抗（rituximab）相关的HCV活性增强的关系。利妥昔单抗是人类CD20的特异性单克隆抗体，能造成B细胞耗竭。在HCV感染患者体内，miR-155能促进B细胞的表达上调。Liao等［42］用体外细胞实验证明：利妥昔单抗可诱导B细胞耗竭，影响细胞内miR-155的产生及外泌体miR-155的传递，从而增强肝细胞内HCV活性。他们还发现，与未感染HCV的类风湿性关节炎患者相比，HCV感染合并类风湿关节炎（RA）的患者血清样本中的外泌体和外泌体miR-155水平显著增强［43］。另外TLR3诱导的巨噬细胞外泌体的miRNA29家族也能有效地抑制HCV在Huh7细胞中的复制［44］。所以，外泌体miRNA可能成为一种潜在的HCV治疗靶点［42］。

2.4 日本脑炎病毒（JEV）

JEV是亚太地区黄病毒脑炎的主要病原体。绝大多数感染病毒的人没有明显症状，但在少数感染病例中仍会出现严重的临床症状，特别是在儿童中死亡率很高。大多数存活下来的感染者往往遗留永久性的神经缺陷，包括癫痫、瘫痪和智力迟钝［45］。

脑脊液中存在大量外泌体，而脑脊液中循环miRNA的改变与多种神经性疾病相关。Goswami等［46］研究JEV感染患者脑脊液外泌体miRNA时发现：有10种miRNA上调，6种miRNA下调。进一步发现JEV感染患者脑脊液外泌体miR-21-5p、miR-150-5p和miR-342-3p的表达显著上调，小鼠模型实验同样验证了这一变化，这3种miRNA在感染JEV的急性脑炎患者脑脊液中特异性循环。有趣的是，在不同细胞中，miRNA表达存在差异，例如检测从体外感染JEV神经元细胞上清中提取的外泌体，发现miR-21-5p和miR-150-5p表达上调，而在小胶质细胞中miR-342-3p表达上调。用疫苗株SA14-14-2感染细胞后，这3种miRNA的水平不再被上调，这表明病毒复制可能与外泌体miRNA上调相关。对这些miRNAs假定靶基因的通路分析表明，miR-21-5p、miR-342-3p和miR-150-5p的靶基因参与了TGF-β、NGF、轴突引导和MAPK信号通路［46］。以上证据表明：外泌体miRNA不仅参与了JEV的感染，还可能在宿主抵抗病毒感染的过程中发挥重要作用。因此，miRNA不仅可以作为疾病诊断的指标，也可作为抗JEV的靶点。

2.5 兰加特病毒（LGTV）

LGTV发现于马来西亚兰加特森林，主要通过蜱虫叮咬传播，引起兰加特脑炎。人类对LGTV从节肢动物传播到脊椎动物宿主的过程了解甚少。一项研究首次表明，LGTV侵染ISE6蜱细胞和神经元细胞能促进外泌体的产生和释放，该外泌体含有大量的LGTV RNA、病毒包膜蛋白和非结构蛋白1（NS1），它们具有感染性和复制性，能从节肢动物传播到人皮肤角质细胞和血液内皮细胞。重要的是，感染的脑微血管内皮细胞分泌的外泌体依赖网格蛋白通过血脑屏障，促进LGTV RNA和蛋白质向神经元细胞传递。GW4869可抑制外泌体中LGTV的载量和释放，从而影响LGTV RNA和蛋白质在节肢动物和脊椎动物宿主细胞中的传递［47］。近期研究发现，当LGTV存在蜱虫体内或在蜱细胞内时，节肢动物IsSMase（inhibits sphingomyelinase，一种鞘磷脂D，能催化鞘磷脂等底物的裂解）的表达明显下降，这表明IsSMase的下降水平与蜱细胞兰加特病毒复制活性下降水平相关。LGTV感染诱导IsSMase使鞘磷脂增多，与膜相关的病毒复制和外泌体的发生有关。GW4869能逆转IsSMase的活性和表达水平并降低病毒载量和鞘磷脂的积累［48］。与其他黄病毒科病毒一样，LGTV利用节肢动物源性外泌体作为病毒RNA和蛋白质从载体传递的新途径，这些外泌体在宿主内传播可能导致神经侵袭和神经发生，但宿主相关蛋白能抑制病毒复制。

2.6 西尼罗病毒（WNV）

WNV可引起发热和神经侵入性疾病，如脑炎和脊髓灰质炎。它会引起老年人和免疫功能低下患者的严重疾病，通常会增加死亡风险［49-50］。病毒感染会改变细胞外囊泡的分子组成，研究人员发现WNV感染产生的外泌体不仅含有不具感染性的病毒粒子和病毒RNA，还会改变外泌体内来自宿主细胞的RNA水平，如microRNA、小非编码RNA（sncRNAs）和mRNA。更进一步研究发现：WNV感染过程中有依赖干扰素和不依赖干扰素的过程参与调控RNA进入EVs；感染细胞被IFN-α处理后，对外泌体内宿主mRNA和miRNA影响显著高于sncRNA。深入研究发现，感染细胞分泌的外泌体含有的mRNA参与Wnt信号和I型干扰素信号途径；外泌体内一些小片段RNA（＜300 nt）使得天然免疫应答基因MDA5、TRIM25和ISG15等表达升高从而产生抗病毒效应［51］。

Table 1 Interplay between exosome and Flaviviridae表1外泌体与黄病毒科病毒相互作用

根据以上研究报道，外泌体不仅可以转运病毒组分促进病毒感染，而且可能作为一种新颖、安全有效的抗病毒载体转运抗病毒物质（表1），影响受体细胞或组织的生理功能以及免疫应答，还为穿过各种生物屏障从而抵抗病毒感染提供了有效工具。

3 外泌体与冠状病毒的相互作用

冠状病毒，因其表面的冠状突起而得名，是单正链RNA包膜病毒。冠状病毒科分为冠状病毒亚科（Coronavirinae）和环曲病毒亚科（Torovirinae）。其中冠状病毒亚科又分为α、β、γ和δ 4个属。HCoV-OC43和HCoV-229E最早发现于20世纪60年代末，而HCoV-NL63和HCoVHKU1分别发现于2004年和2005年。α和β冠状病毒只感染哺乳动物，通常引起人类的呼吸系统症状和其他动物的胃肠炎［52-53］。α冠状病毒（HCoVNL63和HCoV-229E）和β冠状病毒（HCoV-OC43和HCoV-HKU1）通常只引起轻微的普通感冒症状。在2002～2003年，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）引起了一场SARS流行，死亡率约10%［54］。中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）由单峰骆驼传播给人类，在2012年造成了严重的流行，死亡率为37%［55］。2019年12月下旬开始暴发的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的病原体是新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。

3.1 猪流行性腹泻病毒

猪流行性腹泻病毒隶属冠状病毒科冠状病毒属，是一种对新生仔猪具有破坏性的肠道病毒，其基因组长度约为28 kb，包括一个5'端非编码区、3'端编码区以及至少7个开放的阅读框。通过定量蛋白质组学分析，从感染猪流行性腹泻病毒或模拟感染的新生仔猪中分离血清外泌体，证明了血清外泌体不存在病毒蛋白。而在血清外泌体中发现了10个补体蛋白，并且检测到猪流行性腹泻病毒感染的血清外泌体中C3、C6和CFB补体的表达水平明显低于模拟感染的血清外泌体。进一步研究证明，模拟感染的新生仔猪外泌体抑制了猪流行性腹泻病毒感染；然而，这种抑制作用在外泌体被热灭活后消失，这表明C3、C6和CFB补体是关键的抗病毒分子［56］。

3.2 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒

SARS-CoV基因组约有30 000个核苷酸，含编码病毒的4个结构蛋白和16个非结构蛋白［57］。该病毒主要造成人类非典型性肺炎，重症患者可发生呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、休克和多脏器功能衰竭等症状。虽然2003年SARS疫情已经被控制，但是仍然需要开发疫苗以应对将来再次流行的可能性。由于S蛋白与DC-SIGN家族成员和血管紧张素转换酶2（ACE2）结合［58-59］，从而介导病毒进入靶细胞，所以将该蛋白质作为研制抗SARSCoV疫苗的靶点。研究人员探索了含有SARS冠状病毒S蛋白的外泌体疫苗，SARS S蛋白的胞浆和跨膜结构域被水泡性口炎病毒的G蛋白结构域所取代，获得了含S蛋白的外泌体。相对于野生型S蛋白，嵌合S蛋白在细胞表面水平表达更高，并可增强外泌体的释放。在小鼠体内检测该疫苗的免疫原性和效力，并与表达S蛋白的腺病毒载体疫苗进行比较，发现含S蛋白的外泌体和腺病毒载体疫苗都能诱导中和抗体。用SARS-S蛋白外泌体疫苗启动和腺病毒载体增强后，中和抗体滴度超过了SARS患者恢复期血清中的水平［60］。相对于灭活病毒疫苗和其他种类的疫苗，外泌体疫苗不仅包含病毒蛋白，也包含多种细胞蛋白，其中一些蛋白质已经被证明有利于诱导免疫反应，但这些额外的刺激信号是否有利于诱导中和抗体的产生还有待于研究。

3.3 新型冠状病毒

SARS-CoV-2在世界大规模流行，给各国人民的健康和经济发展带来了严重威胁。该病毒造成急性呼吸窘迫、胃肠道窘迫、神经功能损害、嗅觉和味觉丧失、血液凝固失调、肝损伤，急性心脏和肾脏损伤等症状。虽然病毒和宿主基因变异是影响疾病严重程度和免疫反应结果的可能因素，但SARSCoV-2易感性和疾病表现变化的潜在机制目前尚不清楚。

病毒能诱导宿主细胞脂质体发生变化，并挟持关键的能量途径，从而为病毒感染的不同阶段提供能量。研究人员利用质谱分析了轻度、中度和重度COVID-19患者和健康对照者的血浆脂质体和代谢组，发现COVID-19的血浆脂质体与富含单唾液酸二己糖神经节苷脂（monosialodihexosyl gangliosides，GM3）的外泌体相似，即鞘磷脂（SMs）和GM3s水平增加，二酰甘油（DAGs）减少。GM3s与CD4+T细胞计数呈负相关；随着病情加重，COVID-19患者外泌体中的GM3越来越丰富，二者呈正相关关系。因此，富含GM3的外泌体可能参与了与COVID-19发病机制相关的病理过程［61］。

大脑是机体的“司令官”，但是大脑如何抵抗病毒感染目前尚不完全清楚。下丘脑在先天免疫与适应性免疫中发挥重要作用，下丘脑神经干细胞/祖细胞（hypothalamic neural stem/progenitor cells，htNSC）大量分泌外泌体进入脑脊液，而有些外泌体中的microRNA则被释放［62］。利用慢病毒为载体构建SARS-CoV-2假病毒，研究者发现从小鼠下丘脑神经干/祖细胞以及海马NSC中分离出的外泌体/微泡（exosomes/microvesicles，Ex/Mv）对不同组织细胞具有天然抗病毒效应，在无细胞环境中也可以攻击和降解病毒。令人惊奇的是，SARS-CoV-2假病毒侵染表达ACE2的NSC细胞系诱导产生的Ex/Mv在减少病毒感染方面比基础Ex/Mv更强，这表明它参与了一种类似抗病毒的适应性免疫功能。进一步研究发现，NSC Ex/Mv具有大量piRNAs（P element-induced wimpy testis（PIWI）-interacting RNAs），其中一些piRNAs在病毒侵染时表达水平上升，可能参与了Ex/Mv的抗病毒作用［63］。综上所述，NSC Ex/Mv具有抗病毒免疫功能，有望发展成为对抗多种病毒的药物。值得注意的是，NSC可能不是产生抗病毒囊泡的唯一细胞类型，探索和发现具有此功能的其他类型的细胞，对于抗病毒将非常有价值。研究者发现，唾液细胞外囊泡（包括外泌体）可以抑制ZIKV传播，但是不能抑制SARS-CoV-2传播［37］。

大多数SARS-CoV-2候选疫苗选择S蛋白进行免疫。研究者开发了一种新的SARS-CoV-2疫苗策略，使用外泌体传递多种SARS-CoV-2结构蛋白的mRNA［64］。研究人员首先对293F细胞产生的外泌体进行了纯化，并装载了设计用来表达人工融合蛋白LSNME，它包含S蛋白的受体结合域、以及N、M和E蛋白的mRNA。将疫苗LSNME/SW1注射到13周龄雄性C57BL/6J小鼠体内，免疫小鼠产生了CD4+和CD8+T细胞反应，对SARS-CoV-2的N蛋白和S蛋白均显示出剂量依赖的抗体反应，并且达到了预期的持久反应［64］。这种新型外泌体疫苗与传统疫苗相比，不仅含有病毒蛋白，还具有已经证明可以促进免疫应答的细胞蛋白，有利于诱导中和抗体的产生，对于SARS-CoV-2疫苗的研究具有重要意义。

冠状病毒感染产生的外泌体同样可含有病毒蛋白，以及外泌体内宿主细胞蛋白或RNA可能参与了宿主抵抗病毒的免疫过程（表2）。虽然还不知道以外泌体为靶点或载体的治疗方法以及外泌体疫苗对人类的效果，这些研究为目前正在全世界大流行的SARS-CoV-2的预防和抗病毒治疗提供了一种可能性，具有重要的现实意义。

Table 2 Interplay between exosome and Coronaviridae表2外泌体与冠状病毒科病毒的相互作用

4 总结与展望

本综述探讨了外泌体在黄病毒科病毒传播和宿主免疫应答过程中的作用。一方面，黄病毒科病毒相关的外泌体促进病毒感染。黄病毒科病毒可以利用外泌体越过内皮屏障或逃脱免疫监视，增强病毒的传播能力，还能在个体的不同细胞内或跨不同属传播，增加可被感染的细胞类型。另一方面，外泌体可作为免疫系统的诱饵。含有病毒成分和宿主细胞物质的外泌体能够激活免疫反应，以抑制病毒的传播。

本综述还探讨了外泌体与冠状病毒的关系。外泌体可能有助于冠状病毒的传播：一方面，病毒受体蛋白如ACE2等可能会被分选进入外泌体，使受体细胞容易受到病毒感染；另一方面，病毒可能被引导进入外泌体途径，其成分被包装到外泌体中进行分泌，利用外泌体逃逸免疫监视从而促进传播。外泌体具有抗SARS-CoV-2功能：外泌体不仅可以诱导天然免疫反应和适应性免疫反应抗病毒，还可以包裹病毒蛋白作为疫苗诱导中和抗体的产生。基于外泌体可以建立多种SARS-CoV-2感染治疗策略，如抑制外泌体生物发生和摄取、外泌体治疗、基于外泌体的药物递送系统和基于外泌体的疫苗。

总之，对外泌体的研究已经成为研究病毒感染的新视角。外泌体作为物质交换和信息交流的媒介，在病毒与宿主细胞间的相互作用中起着重要的作用。了解与RNA病毒感染相关外泌体的分子机制，丰富对于病毒进入、复制、传播和感染的认识，还将有助于开发更好的策略来预防和诊治黄病毒科病毒和冠状病毒引起的疾病。