假单胞菌生物被膜核心胞外多糖生物合成系统研究进展*

刘佳文 吴倩 张昭寰 童金蓉 黄振华 刘静 潘迎捷 赵勇***

（1）上海海洋大学食品学院，上海 201306；2）上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3）农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306；4）上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

假单胞菌是常见的需氧型革兰氏阴性细菌，广泛地分布在空气、土壤、水，以及人体皮肤、消化道和呼吸道中，可造成严重的水体污染，引起人体呼吸道、泌尿系统及血液等多部位的慢性或急性疾病。生物被膜是细菌细胞及其分泌物（如胞外多糖、胞外蛋白质和胞外DNA等）黏附在生物或非生物材料表面而形成的多细胞聚集体［1］，生物被膜的形成加剧了假单胞菌的危害，可增强假单胞菌的致病性和耐药性，严重威胁人类健康。

胞外多糖是假单胞菌生物被膜的主要成分，在其生物被膜黏附、发育、成熟过程中发挥重要作用，并能增强细菌对宿主细胞的侵袭力以及对抗生素类药物的耐受性［2］。研究表明，与假单胞菌生物被膜形成直接相关的3种核心胞外多糖为：褐藻胶、Psl和Pel，它们分别通过褐藻胶生物合成系统（alginate biosynthetic system）、Psl生物合成系统（Psl biosynthetic system）和Pel生物合成系统（Pel biosynthetic system）进行合成和转运［3］。这3个生物合成系统主要包含4类蛋白质：胞内蛋白、内膜蛋白、周质蛋白和外膜蛋白。胞内蛋白位于细胞内膜内侧，参与胞外多糖的合成，并负责将多糖从胞内向内膜转运。内膜蛋白位于细胞内膜，参与多糖的进一步修饰，并负责将多糖传递给周质蛋白。周质蛋白位于细胞的周质空间中，负责将多糖从周质空间到外膜。外膜蛋白位于细胞外膜，负责将胞外多糖转运到细胞膜外，最终参与假单胞菌生物被膜的形成，使细菌能够抵抗外界不良环境的入侵，导致严重的医疗、环境及食品安全问题［4］。

关于假单胞菌褐藻胶、Psl和Pel胞外多糖生物合成系统的研究已经陆续开展（表1），明晰其具体的结构和功能，有助于人们更好地理解假单胞菌生物被膜的形成机理，并为抗被膜制剂的研发提供精准的三维靶标和理论基础。因此，本文系统地介绍了假单胞菌生物被膜3种核心胞外多糖的生物合成系统，并详细地阐述了各蛋白质的结构、功能以及相互作用关系，最后对假单胞菌生物被膜胞外多糖生物合成系统的进一步研究提出展望。

Table 1 Function of known structure proteins in the core exopolysaccharide biosynthetic systems of Pseudomonas表1假单胞菌核心胞外多糖生物合成系统中已知结构蛋白质的功能

1 褐藻胶胞外多糖生物合成系统

褐藻胶是一种由β-D-甘露糖醛酸及其C5异构体α-L-古罗糖醛酸组成的阴离子多糖［18］，是假单胞菌生物被膜的主要成分，也是假单胞菌产生黏附性的主要原因。褐藻胶的合成和转运需要13个蛋白质：胞内蛋白AlgA、AlgC和AlgD；内膜蛋白Alg8、Alg44；周 质 蛋 白AlgI、AlgJ、AlgF、AlgX、AlgG和AlgL；外膜蛋白AlgK和AlgE。它们的合成和转运过程如图1所示。首先，单糖在AlgA、AlgC和AlgD的作用下转化为GDP-甘露糖酸，然后GDP-甘露糖酸经聚合酶（Alg8和Alg44）的催化后生成甘露聚糖。在AlgI、AlgJ、AlgF和AlgX的协同作用下，通过乙酰化作用对该聚合物进行改性，并通过AlgG及AlgL将其异构化，形成成熟的褐藻胶。最后，成熟的褐藻胶在AlgK参与的周质多蛋白复合物介导下穿过外膜的AlgE蛋白转运到细胞外。

1.1 胞内褐藻胶前体合成酶AlgA、AlgC和AlgD

褐藻胶的前体物质D-甘露糖酸在细菌细胞内合成，其合成主要分为以下4步：a.果糖-6-磷酸在AlgA的磷酸甘露糖异构酶（PMI）活性作用下生成甘露糖-6-磷酸；b.甘露糖-6-磷酸经AlgC催化生成甘露糖-1-磷酸；c.甘露糖-1-磷酸进一步在AlgA的GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）活性作用下生成GDP-甘露糖；d.GDP-甘露糖在AlgD的催化下生成GDP-甘露糖酸［19］。这些参与核苷酸结合的酶至少存在1个罗斯曼（Rossmann）折叠结构域，由交替的β链和α螺旋组成的二级结构，中心的6股平行β折叠连接到周围的5个α螺旋，这种结构能够产生或结合糖核苷酸前体［4］。

AlgA是一种双功能酶，表现出磷酸甘露糖异构酶（PMI）和GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）活性［20］，但其结构尚未确定。Regni等［5］在2002年解析了AlgC的晶体结构，是一种磷酸甘露糖变位酶，包含4个大小相近的结构域，这4个结构域排列成“心形”，并在其中心形成1个大的活性位点裂缝。研究表明，前3个结构域具有相同的拓扑结构，由夹在两个α螺旋之间的4股β折叠混合组成，而第4个结构域具有类似于TBP超家族蛋白（TATA-box binding protein superfamily）的结构，由2个α螺旋和4股反向β折叠组成。此外，AlgC结构中还包含4个活性位点：位于108位的丝氨酸涉及磷酰基团转移；位于242～246的残基具有Mg2+螯合性；位于324～328残基的糖结合环能区分相关的糖底物；位于421位的精氨酸能与双磷酸化反应中间体相互作用。若基于这些活性位点设计抑制剂，将有可能抑制褐藻胶的生物合成，促进宿主免疫系统对细菌生物被膜的清除作用，增加抗生素的疗效。

Fig.1 Alginate extracellular polysaccharide biosynthetic system图1褐藻胶胞外多糖生物合成系统

AlgD是一种GDP-甘露糖脱氢酶（GMD），2003年Snook等［6］得到了该蛋白质与GDP-甘露酸复合物的晶体结构。研究表明，AlgD是一个结构域交换的二聚体，每个亚基包含2个大小相似的结构域，分别位于N端和C端，由33个残基的α螺旋连接，其活性位点位于两个结构域的裂缝中。N端结构域包含完整的二核苷酸结合基序，由一个6股平行的β折叠和5个α螺旋组成。C端结构域以3个α螺旋开始，随后是一个二核苷酸结合基序。AlgD单体的N端结构域与另一个AlgD单体的C端结构域能够紧密结合，高度交织形成二聚体，在细胞质中，两个AlgD二聚体相互作用形成四聚体结构，从而将GDP-甘露糖催化成为GDP-甘露糖酸。

1.2 跨内膜复合物Alg8和Alg44

Alg8和Alg44均位于假单胞菌细胞内膜上，共同组成了跨内膜的复合物［21］。Alg8是一种糖基转移酶，其三维结构未知，Oglesby等［22］预测其含有4个跨膜螺旋以及1个可溶性胞质环。在胞质环中存在2个结构域，其中结构域A与II类β糖基转移酶的序列同源性较高，含有保守的天冬氨酸残基和DXD氨基酸基序，可能分别是NDP-葡萄糖和受体分子的结合位点；结构域B含有一个保守的天冬氨酸残基和LXXRW氨基酸基序，可能负责将多个NDP-葡萄糖转移到受体分子。Remminghorst等［23］经实验证明，Alg8是褐藻胶生物合成的关键，alg8的过表达会导致褐藻胶产量增加、乙酰化以及差向异构化。

Alg44在体内以同源二聚体的形式存在，其N端有1个锚定于膜上的信号肽，以及1个位于细胞质的PilZ结构域，该结构域能够结合环二鸟苷酸（c-di-GMP）并调节褐藻胶的聚合［24-26］。Whitney等［7］解析出了Alg44胞质域与c-di-GMP复合物的结构，该结构呈现出1个分裂的桶状结构，包含6个反向平行的β链和1个α螺旋。Alg44蛋白C端含1个TM结构和周质域，其周质域中包含膜融合蛋白（MFP）结构，在褐藻胶前体GDP-甘露糖酸的聚合和修饰中发挥作用。Ogelsby等［22］认为Alg44蛋白的MFP结构域能够通过蛋白质间相互作用，向Alg44的N端发送构象信号，影响Alg8聚合D-甘露酸的能力，从而控制Alg44蛋白的PilZ结构域与c-di-GMP结合。

1.3 周质中乙酰化修饰蛋白AlgI、AlgJ、AlgF和AlgX

GDP-甘露糖酸形成多聚物后将进一步在周质空间内进行乙酰化修饰［27］，该乙酰化过程发生在甘露糖残基的C2和C3羟基，由AlgI、AlgJ、AlgF和AlgX构成的乙酰化复合物进行修饰。在细胞质中，AlgI与未知的乙酰供体分子相互作用，并穿过内膜将乙酰供体转移到AlgJ或AlgF。AlgX从AlgJ或AlgF中接收乙酰供体分子，然后催化褐藻胶的直接O-乙酰化［28］。目前关于AlgI的具体结构尚未研究，AlgJ、AlgF和AlgX的结构于近些年陆续得到解析。

Baker等［9］解析了恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）AlgJ周质域的结构，该蛋白质含有4个平行的核心β链（β3、β6～8），在9个α螺旋（α1、α3～10）的包围下共同形成了α/β/α折叠，两个反向平行的β链（β4和β5）位于α/β/α折叠的侧边，且其顶部有一个α2、β2和β3链组成的帽子结构。Ser-His-Asp保守催化三残基是该蛋白质表现出O-乙酰化活性的原因，其中D190和H192残基位于帽子结构中，而S288位于α/β/α折叠中。AlgF的结构已经被解析，发布于PDB数据库中（PDB ID：6CZT），具有2个串联的β三明治结构，介导AlgJ蛋白与AlgX蛋白相互作用，负责乙酰基的转移［3］。

Riley等［10］解析了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）AlgX的晶体结构，它是一种双结构域蛋白，其N端含有α/β/α拓扑结构，包括7个核心α螺旋，与SGNH水解酶超家族具有结构同源性，不同之处在于AlgX只包含5股平行β股的前4股，第5股为单残基β桥（W153），且这4个核心β链的顺序也不同。D174、H176和S269残基组成了水解酶结构域的催化三联体，负责乙酰基向褐藻胶转移。AlgX的C端为碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding module，CBM），呈现最常见的β三明治折叠，每个β折叠包含4个反向平行的β链。CBM中的芳香氨基酸和极性保守残基存在于蛋白质表面的凹槽中，形成一个独特的底物识别“夹点”，该“夹点”的存在有助于增加多糖-蛋白质复合物的稳定性。因此，GDP-甘露聚糖可在C端与AlgX结合，通过夹点并沿保守路径运动，然后通过AlgX的N端向GDP-甘露聚糖中添加乙酰基，从而实现多聚物的改性。

1.4 周质中异构化蛋白AlgG和AlgL

AlgG是一种C5差向异构酶，Wolfram等［8］解析了丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）AlgG蛋白的晶体结构，AlgG的主干是一个右手平行β螺旋，包括11个完整线圈和1个不完整线圈，每个线圈由3个β折叠组成，依次由3个转弯环连接。线圈4～10形成一个碳水化合物结合/糖水解结构域（carbohydrate-binding/sugar hydrolysis domains），N端的1个帽状螺旋与2个反平行的β折叠共同形成该结构域的盖子。AlgG能在聚合物水平上将甘露酸残基转化为古鲁酸，从而生成甘露酸、古鲁酸交替排列的成熟褐藻胶。Jain等［29］认为AlgG除了具有异构酶活性，还能保护新生褐藻胶在穿过周质时不被AlgL降解。AlgL是一种褐藻胶水解酶，呈现（α/α）6桶状折叠，能够裂解没有从周质空间中转出的褐藻胶，从而防止其在周质空间的积累［30-31］。

1.5 外膜蛋白AlgK和AlgE

Keiski等［11］的结构解析表明，AlgK是一种外膜脂蛋白，由22个α螺旋组成的紧凑超螺旋结构，其中1个N端螺旋与超螺旋结构的凹面相结合，其余21个反向平行的α螺旋聚集形成右手超螺旋。AlgK有3个蛋白质相互作用位点，其中2个作用位点靠近N端的脂质锚，从而直接与AlgE的周质环相互作用，位于C端的作用位点可能与周质蛋白或内膜蛋白结合。研究认为，该蛋白质具有至少9.5个TPR基序（tetratricopeptide-like repeat），在大型蛋白质复合物的组装中发挥支架作用，可与AlgE、Alg8和Alg44相连接，并与AlgX和AlgG一起形成跨周质通道［32-33］。Tan等［34］研究认为，AlgK可能是以“末端对末端”的形式与AlgE的周质孔相连接，有效延长了褐藻胶的输出长度，以便于其通过AlgE的β桶。

Whitney等［12］在2011年对外膜蛋白AlgE的结构进行了研究，证明该蛋白质是由18个β股（S1～S18）组成的反向平行β桶状结构，含9个胞外环（L1～L9）和8个周质环（T1～T8），能自发地结合到细胞外膜上，其内部带正电性，可与带电负性的褐藻胶结合。Tan等［34］认为L2和T8分别为该蛋白质的胞外门和周质门，通过两个门控的开放与关闭来调节褐藻胶的转运。L2可能通过二价阳离子稳定电负性的脂多糖（LPS），以防止LPS干扰褐藻胶的有效分泌。周质环T8的构象很灵活，可以向下和向外运动，负责将AlgE蛋白由“关闭”构象转变为“开放”构象，使AlgE与AlgK直接相互作用，从而促进褐藻胶向膜外转运。胞外环L3和L7折叠到桶腔中，占据了通道的大部分体积从而限制孔隙的大小，有助于该蛋白质结构的稳定［35］。研究还发现，AlgE的周质T4是维持AlgE、AlgK、AlgX和Alg44形成稳定多蛋白质复合物的重要区域［36］。

2 Psl胞外多糖生物合成系统

Psl是一种由D-甘露糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖组成的中性五糖［37］。其合成和转运由Psl胞外多糖生物合成系统负责［38］。Psl操纵子包含12个基因（PslA、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L），当前只有PslG的周质域结构得到解析，其余蛋白质结构仍是未知。Psl胞外多糖的生物合成系统如图2所示，糖-核苷酸前体经PslB合成后，通过PslF、PslH、PslI和PslC转移糖基形成Psl重复单元，然后由内膜蛋白PslA提供一个位点，将Psl重复单元组装到细胞质的类异戊二烯脂质上，同时在PslJ、PslK和PslL等内膜蛋白的作用下，Psl多糖聚合并穿过细胞内膜，随后PslE作为周质支架帮助Psl多糖穿过周质，最终Psl多糖经PslD到达细胞膜外［39］。

2.1 胞内蛋白PslB、PslF、PslH、PslI和PslC

PslB、PslF、PslH、PslI和PslC位于细胞质中，具体三维结构均属研究空白。PslB是一种与AlgA相似的双功能酶，预测具有N端GMP结构域和C端PMI结构域，参与糖-核苷酸前体的生产［37］。PslF、PslH和PslI与分枝杆菌的磷脂酰肌醇甘露醇转移酶PimA结构具有相似性，具有糖基转移酶（glycosyltransferase，GT）结构域，属于CAZyGT-4家族的酶，采用GT-B折叠，通过保留机制转移糖基残基，可能负责将活化的糖亚基加入到Psl多糖的重复结构中。PslC与小鼠多肽α-N乙酰半乳糖氨基转移酶T1结构相似，属于CAZyGT-2家族，采用GT-A折叠，可以负责葡萄糖、鼠李糖和甘露糖等多种核苷酸激活糖的转移。根据PslF、PslH、PslI和PslC的预测结构，这些酶可能负责转移糖-核苷酸前体的糖基，从而形成Psl多糖重复单元［4］。

2.2 内膜蛋白PslA、PslE、PslJ、PslK、PslL和PslG

PslA、PslE、PslJ、PslK、PslL和PslG这6种内膜蛋白都具有跨膜结构域，可能在细胞内膜上组成复合物。目前，除了PslG的可溶域结构之外，其余5种蛋白质的结构尚不明确。PslA与细菌的WbaP蛋白结构相似，具有聚异戊二烯糖基磷酸转移酶活性，可能为Psl低聚糖重复单元提供1个位点，将其组装到内膜细胞质侧的类异戊二烯脂质上［4］。PslE的周质域与大肠杆菌内膜蛋白Wzz存在结构相似性，是一种卷曲的线圈结构，单体可组装成具有中心孔的六聚体或八聚体［40］。Wu等［41］研究表明，PslE可能作为支架，与PslA、PslD相互作用形成内膜复合物，促进Psl多糖向周质空间转运。PslJ没有明显的结构同系物，PslK蛋白与霍乱弧菌NorM蛋白结构相似，能够通过挤压的方式将多糖分子转运至周质空间［42］。PslL具有酰基转移酶3结构域，但Psl多糖不被小官能团修饰，因此很难推测PslL的具体作用［4］。

Fig.2 Psl extracellular polysaccharide biosynthetic system图2 Psl胞外多糖生物合成系统

Baker等［13］解析了PslG蛋白第31～442位氨基酸的周质域结构，PslG（31～442）具有糖苷水解酶活性，包含2个结构域：N端的（β/α）8桶状结构中有6个大环（L1～L6），这些大环包含小的二级结构元件，能够连接（β/α）8折叠中的α螺旋和β折叠，形成1个长约32Å的镰刀形深槽。C端的β三明治结构由1个小β折叠和在（β/α）8催化结构域之后的6个β折叠组成。Wu等［41］研究表明，在PslG蛋白中，与内膜结合部分有助于Psl的合成，周质部分表现出水解活性，与Psl胞外多糖的产生和初始黏附有关。

2.3 外膜蛋白PslD

PslD位于细胞外膜上，与大肠杆菌荚膜转位酶Wza结构相似，具有八聚体结构，存在1个大的中心腔，推测其与Wza具有相同的多糖跨膜转运功能，可帮助Psl多糖从周质空间转移到细胞膜外［43］。不同之处在于，PslD具有2个周质离散环，而Wza比它多1个，并且PslD似乎缺乏外膜的α螺旋桶状结构，因此在PslD具体的三维结构被解析出来之前，对于其转运Psl多糖通过外膜的转运机制研究尚属空白。此外，Wu等［41］研究表明，PslD与PslE具有很强的相互作用，这种相互作用有助于PslD在外膜上的定位。

3 Pel胞外多糖生物合成系统

Pel是一种由部分乙酰化的N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺组成的阳离子胞外多糖［44］，能够使假单胞菌在气-水界面形成一层薄膜，可以帮助细菌抵抗氨基糖苷类抗生素，在生物被膜基质中发挥结构和保护作用。参与Pel胞外多糖生物合成系统的7个蛋白质由7个基因操纵子pelA、B、C、D、E、F、G编码，其合成转运过程如图3所示：PelF蛋白以UDP-葡萄糖为底物将糖基转移到Pel多糖上，PelD蛋白与c-di-GMP结合调控Pel多糖的转运，位于内膜的PelE和PelG帮助Pel多糖穿过内膜，周质中的伴侣蛋白PelA将Pel多糖修饰为成熟的阳离子多糖后，成熟的Pel多糖被PelC吸引穿过外膜的PelB桶孔最终到达细胞外。

Fig.3 Pel extracellular polysaccharide biosynthetic system图3 Pel胞外多糖生物合成系统

3.1 胞内蛋白PelF

PelF是一种糖基转移酶，位于细胞质中，不含跨膜螺旋，以UDP-葡萄糖为底物合成Pel多糖［45］。在CAZy数据库中，该蛋白质属于GT-4家族，呈现GT-B折叠，并且C端含有EX7E基序［46］。E405和E413是EX7E基序中的2个保守残基，但E413对PelF蛋白的酶活性并没有影响。PelF还包含2个保守DXD基序，但与其他糖基转移酶不同，这4个天冬氨酸对PelF蛋白的酶活性没有影响。此外，K330和R325氨基酸残基对PelF的酶活性有重要作用，可与UDP-葡萄糖磷酸根的氧原子作用形成氢键。

3.2 内膜聚合物PelDEG

内膜上的PelD、PelE和PelG蛋白组成一个三联体复合物，参与Pel胞外多糖的跨内膜转运。Whitfield等［47］研究证明PelDEG复合物与PelF相互作用并帮助PelF定位于内膜，但PelDEG复合物的结构仍未知，仅有PelD胞质域的结构被解析。

Whitney等［14］对PelD蛋白第156～455位氨基酸的胞质域结构进行了研究，PelD（156～455）含4个跨膜螺旋，第4个跨膜螺旋延伸到细胞质中，连接跨膜结构域与可溶性细胞质区域。N端含有1个GAF结构域，其拓扑结构为ααββαββα，C端为GGDEF结构域，其拓扑结构为αβαββαβα，二者经一段无序的短链连接，形成了1个653Å2的界面。在GGDEF结构域中存在保守的RXXD基序，可作为与c-di-GMP结合的I位点。当c-di-GMP与该位点结合时，N端的GAF结构域会发生14°旋转，使得界面的面积从653Å2减小为609Å2，以调控Pel多糖的生物合成。PelE包含1个I型输出信号单元和2个跨膜螺旋结构域，这种排列使得PelE的大部分C端位于周质空间中［48］。预测C端区域都是α螺旋，含有至少有4～5个TPR基序，可作为支架蛋白，通过与PelA和PelB相互作用，促进Pel多糖的转运。PelG与霍乱弧菌的NorM结构相似，预测含有12个TM结构域，可能与MATE蛋白家族成员具有相似的功能，在Pel多糖通过内膜的过程中发挥作用［42］。

3.3 周质伴侣蛋白PelA

PelA是Pel多糖的伴侣蛋白，主要位于周质空间中［49］。通过生物信息学分析发现，PelA含两个主要的结构域，N端为糖苷水解酶域（glycoside hydrolase，GH），属于GH114家族，该区域的结构已经被解析（PDB ID：5TCB），呈现β8/α7TIM桶状结构，其中有1个高度电负性的裂缝，内表面为保守的酸性残基，在阳离子多糖的结合中起到关键作用［3］。C端结构域为碳水化合物酯酶域，表现出金属依赖的脱乙酰酶活性，被证明与Pel多糖的合成直接相关。Pel多糖在周质空间中能够通过PelA进行脱乙酰化修饰，形成成熟的Pel多糖。

3.4 外膜上的复合物PelBC

PelB的N端含19个连续的TPR结构基序，可作为该系统中其余蛋白质的结构支架［4］。Marmont等［16］研究表明，该TPR结构域的离散区域能够与PelA相互作用，但每个TPR基序的作用又有所不同，其中R9～R14能够促进PelA在周质空间中的定位，R15～R19可以作为重复的“间隔区”，引起PelA和PelC之间的空间碰撞。PelB能够将PelA“招募”到外膜，并与PelA直接相互作用，诱导PelA发生构象改变，使其脱乙酰酶活性增加，水解酶活性降低，使得Pel多糖更有效的脱乙酰化。Marmont等［17］经实验证明，PelB的C端为跨膜β桶状结构，预测由16个β链组成，负责将Pel多糖转运到膜外。C端β桶结构域和N端TPR结构域之间是一段约120个残基的连接区域，其具体的结构还无法预测，推测这段结构穿过PelC的中间孔，并与其相互作用。

PelC为外膜脂蛋白，位于外膜的内侧。Marmont等［17］解析了PelC的结构，结果表明PelC单体为混合的α/β折叠，在体内形成中心约30Å孔隙的十二环状聚合物。该聚合物类似于1个没有柄的“漏斗”，凸面靠近细胞外膜，与磷脂的电负性基团相互作用。N端的149位色氨酸保守残基在孔内聚合形成1个芳香带，负责将PelC聚合物锚定在外膜上。而PelC的凹面呈高度电负性，负责将带正电荷的Pel多糖吸附到“漏斗”内部，将其引导进入PelB的β桶中，并将其转运到细胞膜外，参与假单胞菌生物被膜的构筑。

4 总结与展望

假单胞菌被视为研究生物被膜的模式菌株，褐藻胶、Psl和Pel胞外多糖是假单胞菌生物被膜的重要组成部分，能够帮助细菌细胞抵抗外界的不利条件，其合成和转运依赖于对应的褐藻胶、Psl和Pel胞外多糖生物合成系统。本文系统地总结了这3种系统相关蛋白质结构生物学的研究进展，在微观层面阐述了这些系统的相关功能，可为假单胞菌胞外多糖合成、转运和分泌的进一步研究奠定扎实的理论基础，并为进一步揭示细菌生物被膜的形成机制提供新的视野及思路。基于以上假单胞菌胞外多糖生物合成系统的研究现状，本文对其未来的研究方向提出以下两点展望。

4.1 解析相关膜蛋白及复合物的未知结构和功能

在目前已经解析的假单胞菌胞外多糖生物合成系统的三维结构中，除了AlgE之外，大多数研究均集中于可溶性蛋白、或者膜蛋白的可溶部分，对于这3种系统相关膜蛋白的研究还相对较少，尤其缺乏膜蛋白复合物的研究，极大限制了人们对于这些生物合成系统作用机制的理解。因此，未来研究应着重针对膜蛋白及膜蛋白复合物的未知结构和功能展开，以明晰此类系统的分子机理及生命调控过程，揭示胞外多糖的生物合成与假单胞菌生物被膜形成之间复杂的相互作用关系，为假单胞菌生物被膜形成机制的研究奠定理论基础。

4.2 研发靶向于胞外多糖生物合成系统的新型抗生物被膜制剂

生物被膜是假单胞菌抵抗外界不利条件的保护屏障，胞外多糖在该保护屏障中起着结构支撑作用，其合成转运依赖胞外多糖生物合成系统。若针对性地破坏这些蛋白质的活性，能够有效阻断胞外多糖合成转运过程，从根本上控制细菌生物被膜的形成。虽然目前已有多种抗生物被膜制剂被陆续研发，但仅停留于破坏胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA的层面［50］。胞外多糖生物合成系统的存在，将不断地为细菌输送新合成的胞外多糖，导致细菌生物被膜的再次形成。因此，未来新型抗生物被膜制剂的研究，可基于胞外多糖生物合成系统设计靶向控制策略，从源头上彻底清除细菌生物被膜。