枳术丸对功能性消化不良的治疗作用机制探讨

何凡应，徐汪君，黄柳向

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410007

功能性消化不良是指由胃和十二指肠功能紊乱引起的症状，而无器质性疾病的一组临床综合征，临床主要表现为上腹部胀满、疼痛不适，食欲不振、恶心呕吐、胃脘部烧灼感等不适症状[1]。在中医中并无功能性消化不良病名，而是根据其临床表现，将其归属于胃痞、胃痛范畴。素问其病位在脾胃，与肝密切相关，还可涉及肺和大肠。基本病机为肝郁气滞，脾胃虚弱[2]。《景岳全书·痞满》言：“怒气暴伤，肝气未平而痞皆有呕证”。若平素忧思恼怒，则易伤肝损脾，脾胃受损，则不思饮食，脾胃为升降枢纽，其受损中焦升降失常，肝郁还可犯胃，甚至呕吐，进而发展为本病。

枳术丸由枳实、白术两味药组成，是由张元素在张仲景中金匮要略的枳术汤化裁而来，药物不变，将汤剂改制成丸剂。《金匮要略·水气病脉证病治第十四》云：“心下坚大如盘，边如旋盘，水饮所作，枳术汤主治”。枳实性苦、辛、微寒，归脾胃经，具有破气消积，化痰散痞之功。白术性甘苦温，归脾胃经，功效为健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎。二者相配伍，枳实主消，白术为守，一走一守，一消一补，相互制约互用，共奏疏肝健脾，消食化积散痞之功。若单纯健脾补气而不消滞行气，则恐补而壅滞， 积痞难去，若一味行气消滞而不辅以健脾益气， 则积滞虽可暂去，却有再积之虞。故二者合用，健脾与行气并施， 双管齐下，则可达到消补兼施， 消而不伤正， 补而不碍滞之功[3]。临床上常用其治疗功能性消化不良，并取得了不错的效果。

为进一步揭示枳术丸治疗功能性消化不良的作用机制，本研究采用网络药理学方法对枳术丸进行深入挖掘。

材料与方法

1 枳术丸活性成分靶点的获取

借助中医药系统药理学平台TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[4]，在搜索框中依次输入白术、枳实两味中药，得到其所有活性成分，根据人体对药物吸收、分布、代谢及排泄的药动学参数[5]，再筛选出高活性成分，筛选标准为：口服利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 且类药性（drug-likeness，DL）≥ 0.18，[6]并利用uniprot数据库借助R语言将得到的活性成分统一转化为规范的靶点。

2 功能性消化不良的靶标的收集

利用 genencard（https：//www.genecards.org）数据库[7]，在其搜索框中输入功能性消化不良的英文名，即Functional dyspepsia，搜索后得到该疾病的有关靶标，再选择参数relevance score ＞ 10，得到与该疾病密切相关的常见靶标。

3 枳术丸-功能性消化不良共同靶点的收集

利 用 在 线 画 图 网 站，（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）将枳实、白术，功能性消化不良（Functional dyspepsia）各自的靶标输入其中，得到共同靶标和韦恩图。

4 枳术丸-功能性消化不良共同靶点的PPI网络构建

将得到的共同靶点输入String数据库（https：//string-db.org）[8]，选择参数 MultipleProtein，选定物种为Homosapiens，设定最低要求互动分数为中度信度0.400得到蛋白相互作用（PPI）相关信息并导出PPI网络图与TSV文件，运用R语言将TSV文件目录中node1与node2各个靶点的节点数目degree导出得到xsl表与柱状图。

5 枳术丸-功能性消化不良共同靶点的GO分析

运 用 DAVID 数 据 库（https：//david.ncifcrf.gov）[9]，对共同靶点进行GO富集分析，输入格式选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Background” 选 择“Homo aspiens”，P＜0.05，并将 BP（生物过程）、CC（细胞成分）、MF（分子功能）分别导出，对 P 值取负对数，P 值越小，-lgP大，表明富集程度越大。进行GO分析，将导出后的结果用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在线绘制出GO富集气泡图。

6 枳术丸-功能性消化不良共同靶点的KEGG通路富集分析

运 用 DAVID 数 据 库（https：//david.ncifcrf.gov），对共同靶点进行KEGG通路富集分析，设置的参数同1.5项，将得到的前20条通路进行通路富集分析。并用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在线绘制出KEGG通路富集气泡图。

结 果

1 枳术丸的活性成分及其对应的靶点

通过TCMSP共收集到枳术丸活性成分共120种，其中枳实65种，白术55种，通过筛选共得到活性成分29种，其中枳实22种，白术7种，通过Uniprot数据库借助R语言将其活性成分转化为靶点，删除重复靶点后共得到62个靶点，其中枳实52个，白术10个，见表1。

表1 枳术丸药物活性成分

2 功能性消化不良的靶点

在genencard数据库搜索框中输入功能性消化不良的英文名，即Functional dyspepsia，搜索共得到2452个靶标，选择relevance score ＞ 10，得到与功能性消化不良密切相关的靶标共553个。

3 疾病-药物活性成分的共同靶点

将枳术丸的活性成分得到的靶标与功能性消化不良得到的靶标在（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）中的list 1，list 2，list 3中分别输入后，得到药物疾病共同的靶点共23个，该靶点即是枳术丸对功能性消化不良起治疗作用密切相关的靶点，同时导出韦恩图，见图1。

图1 药物-疾病韦恩图

4 共同靶点的PPI网络

在String数据库中将得到的药物疾病23个共同靶点输入后，设置参数完毕后，得到PPI蛋白互作关系图并导出，见图2；同时导出TSV数据文件，运用R语言对文件进行处理，得到各个靶点的连接节点数的degree的 xls表，见表 2， 其中 EGFR（degree=18）、IL6（degree=18）、VEGFA（degree=18）、CASP3（degree=16）连接节点均大于15，表明枳术丸可通过多个靶点对功能性消化不良起到治疗作用。

表2 药物疾病共同靶点的degree值

5 共同靶点的GO富集分析

23个共同靶点在DAVID数据库中GO富集共得到92对BP，25对CC，28对MF，利用微生信对排在前10的BP、CC、MF在线绘制出GO富集气泡图，见图3，结果显示，共同靶点主要分布于细胞外间隙、细胞表面、高尔基体、细胞质、细胞内体膜等细胞成分中，主要通过酶结合、同蛋白结合、类固醇结合、染色质结合、蛋白磷酸酶结合等方式参与凋亡负调控、上皮细胞增殖、氨基酸反应、雌二醇反应、一氧化氮合成等生物进程。

图3 GO分析富集气泡

6 共同靶点的KEGG通路富集分析

23个共同靶点在DAVID数据库中KEGG富集共得到39条信号通路，富集程度前20位的通路见表3，KEGG富集分析气泡图见图4，共同靶点参与的关键通路为癌症途径、HIF-1信号通路、TNF信号通路、麻疹信号通路等。

图4 KEGG富集分析气泡

表3 共同靶点富集的前20条通路

讨 论

功能性消化不良是一种功能性疾病，临床表现为消化功能改变而无器质性病变，其病因尚未明确，可能与胃动力及感觉异常、精神状态、应激因素、和环境影响有关，与HP感染的关系不密切，酸分泌亦无增加，女性患者较常见，目前西医对其的治疗主要以促胃动力、抑制胃酸分泌、保护胃黏膜及心理疏导为主，治疗效果一般，而中医药对功能性病变的疾病治疗有着极大的优势，尤其是在改善患者的症状这一方面，功能性消化不良对应中医“胃痞”“胃痛”范畴，《素问·六云正纪大论》云：“木郁发之……民病胃脘当心而痛”肝郁气滞，脾胃虚弱乃其基本病机。临床研究发现枳术丸及其衍变方对功能性消化不良的治疗效果良好，李晓玲等人研究发现枳术丸对碘酰胺诱导的功能性消化不良大鼠具有加快胃排空、降低胃肠感觉过敏的作用，其机制可能与外周血Ghrelin、5-HT含量提高，CGRP含量降低有关[10]，沈一山等人将64名功能性消化不良的患者分为橘皮枳术丸组、吗丁啉组，治疗后发现橘皮枳术丸对功效性消化不良的治疗效果优于吗丁啉组，P＜0.05[11]。

网络药理学涉及了多门学科技术，可以从整体上揭示药物、疾病、靶点之间的关系，为中医药治疗疾病对疾病的治疗提供了数据支撑，已广泛应用于单位中药、中药复方作用机制研究[12]。本研究通过对枳实、白术的有效成分检索再筛选，共得到29种活性成分，枳实的主要活性成分有黄铜类、挥发油类、生物碱类、豆香素类。侯雪楠等人发现枳实的主要成分橙皮苷可以增加CUMS大鼠GR表达，抑制下丘脑促肾上腺皮质激素释放，改善过度亢进的HPA轴状态[13]。有研究证实枳实水提物可通过上调5-羟色胺受体4（5-HTR4）和神经丝蛋白H （NF-H）的表达促进神经丝生长， 从而显著改善泻剂结肠大鼠的肠道动[14]。枳实黄酮类化合物具有良好的抗氧化作用，其中黄铜A环中5，7-二羟基为主要活性基团，枳实黄铜能够缓解氧化应激诱导的肺功能损伤，从而改善肺部组织的病理变化[15]。白术的主要活性成分有挥发性成分、内酯类成分、苷类、多糖类成分与氨基酸类成分[16]。曹艳霞等研究发现白术多糖可通过调节Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表达对应激性胃溃疡起到明显的改善作用[17]。宋厚盼等观察白术甲醇提取物可通过促进多胺介导的上皮细胞迁移修复胃肠黏膜的损伤[18]。

本研究发现功能性消化不良与枳术丸的共同靶点共有23个，其中连接节点大于15的靶点有EGFR、IL6、VEGFA、CASP3；研究表明在特定的配体、组织和病理条件下，EGFR的配体直接激活可以产生不同的细胞反应，促进细胞生长和纤维化[19]。IL-6一个典型的促炎性细胞因子，有研究表明，它通过gp130的同源二聚体化激活Janus激酶（JAK）/STAT信号转导通路参与炎症疾病有关进程，，与胃炎的发生发展密切相关[20]。董宏超等发现VEGFA可通过ERK、PI3K/Akt通路调控血管的再生与增值，与多种疾病的发生发展密切相关[21]。有研究表明caspase-3是一种常见被激活的死亡蛋白酶，是细胞凋亡的关键介质，可催化许多关键细胞蛋白的特异性切割[22]。

本研究GO富集分析结果表明，共同靶点分布于细胞的多种成分中，能够多靶点、多结构、多形式、通过多种生物进程，包括凋亡负调控、上皮细胞增殖、氨基酸反应等。细胞凋亡等。KEGG富集结果共得到39条信号通路，其中癌症途径、HIF-1信号通路、TNF信号通路为关键信号通路，癌症途径与多种癌症的发生发展密切相关，如前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、非小细胞癌等。有研究发现，C-X-C基序配体8（CXCL8）是癌症途径中的一种关键因子，发挥着多功能细胞因子的作用，能以自分泌或旁分泌的方式调节肿瘤的增殖，侵袭和迁移，能参与多种细胞内信号传导及整合，以产生协同效应，从而介导各种癌症的发生和发展[23]。缺氧诱导因子-1（HIF-1）是一种重要的转录因子，可在人类癌症中低氧条件下诱导发生适应性反应，有关研究发现在缺氧条件下，BRU抑制了HIF-1的反式激活活性，并抑制了VEGF，GLUT1，HK2和LDHA等HIF-1靶基因的表达。此外，BRU还可以通过抑制HIF-1信号通路来降低缺氧条件下的葡萄糖消耗[24]。TNF（肿瘤坏死因子）是促炎和抗炎细胞因子，对自身免疫性疾病，癌症的发展以及对传染性病原体的保护至关重要。除无数其他活动外，TNF可以是T细胞的产物，并可以作用于T细胞。TNF可以促进中枢和效应T细胞的活化和增殖，但也可以诱导高度活化的效应T细胞凋亡，从而进一步确定病原性或保护性T细胞池的大小。而且，TNF可以对调节性T细胞产生不同的作用。它既可以下调其抑制能力，又可以在其他情况下促进其发展或积累[25]。

综上所述，本研究运用了网络药理学技术，揭示了枳术丸对功能性消化不良的可能的治疗作用机制，但受限于数据库、软件的不足之处，其还可待进一步实验论证其科学性，从而为新药的开发提供有力依据。